Summary
SC1 fonctions à travers la double inhibition de Ras-GAP et ERK1. Nous avons testé la fonction de SC1 dans le soutien des cellules ES de souris auto-renouvellement, en l'absence de LIF et a montré que SC1 est capable de maintenir l'auto-renouvellement des cultures de souris ES cellule.
Abstract
Souris souches embryonnaires (ES), les cellules sont classiquement cultivés avec le facteur inhibiteur de leucémie (LIF) pour maintenir l'auto-renouvellement.
Protocol
1. Préparation des plaques d'alimentation MEF
- Un jour avant que les cellules ES en culture, un flacon de dégel irradiés E14.5 FC-1 des cellules nourricières du MEF (voir notre procédure sur la façon de dégeler les cellules ES).
- Plate cellules nourricières du MEF à une densité de 10.000 cellules / puits dans une plaque 12 puits. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. MEF cellules médias: DMEM supplémenté avec 10% ES-PBS 1X, 1X glutamine et non acides aminés essentiels.
2. Entretien de l'auto-renouvellement des cellules ES de souris
- Détacher les cellules ES à l'aide de trypsine. Ensemencer les cellules à une densité de 50.000 cellules / puits sur des plaques préalablement préparé alimentation MEF dans les milieux de croissance (MEM Knockout complétée par KSR 15%, 4 mM de L-glutamine, 0,1 mM non acides aminés essentiels et 1X BME) complété avec SC1 à la concentration souhaitée (nous avons utilisé 100 nM, 300 nM, et 1 uM). Nous avons également ajouté un contrôle positif et qui a été complété avec 1000 μ / ml de FRV. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Culture des cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 3-4 jours dans chaque passage. Actualiser les médias toutes les 48 heures.
- Cellules Passage 1:10-1:15 à la trypsine pour maintenir une densité similaire à la densité de semis initiale. Après 5 passages, les cellules peuvent être examinées pour l'expression des marqueurs typiques pluripotence utilisant l'immunocytochimie.
3. Examen des marqueurs immunocytochimiques pluripotence
- Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS.
- Fixer les cellules avec 500 pi de fixateur pendant 20 minutes à température ambiante.
- Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS.
- Bloc de fixation non spécifique avec 500 ul du tampon de blocage pendant une heure à température ambiante.
- Incuber les cellules avec 250 pi de l'anticorps primaire spécifique (nous avons utilisé Nanog, Sox2, SSEA1 et Oct4 aux dilutions suivantes: 1:500, 1:2000, 1:500, et 1:500)
- Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS.
- Incuber les cellules avec 250 pi d'anticorps secondaire pendant deux heures à température ambiante, en gardant loin de la lumière (nous avons utilisé d'âne anti-souris conjugué avec Alexa Fluor ® 555 à 1:2000 et d'âne anti-lapin conjugué à Alexa Fluor ® 488 à 1 : 2000).
- Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS.
- Ajouter DAPI (concentration finale 1 ug / ml) pour le dernier lavage et incuber 5 minutes à visualiser les noyaux.
- Analyser les cellules sous un microscope à fluorescence.
4. Les résultats représentatifs:
1. Résultats de la morphologie:
Les cellules ES de souris (CES R1) ont été cultivés sur des cellules nourricières du MEF dans la présence soit d'un FRV ou SC1 pour soutenir l'auto-renouvellement à un état indifférencié. Après le deuxième passage, la différenciation pourrait être observé dans des cellules sans FRV ou SC1 (témoin négatif) et après 5 passages essentiellement aucune colonies indifférenciées ont été observées. FRV (contrôle positif) colonies traitées est resté dans un état indifférencié au long des 5 passages cellulaires. Les cellules traitées avec SC1 à des concentrations de 300 nm ou 100 nm est également resté indifférencié après 5 passages, cependant, les cellules traitées avec 1 uM SC1 mort cellulaire expérimentés après le quatrième passage. (Figure 2 de la note app) Le tableau 1 récapitule les observations morphologiques.
2. Expression de marqueurs pluripotence
Cellules ES de souris maintenu pendant 5 passages ont été fixés et examinés par immunocytochimie pour SSEA1, Oct4, Nanog et Sox2. L'expression du marqueur a été similaire à cellules maintenues en FRV. (Fig 3 et 4 de la note d'application)
Figure 1: Comparaison Morphologie des cellules maintenues en FRV ou SC1. Aucune différence dans la morphologie a été observée.
Figure 2 et Figure 3: Nanog, SSEA1, Sox2 et Oct4 coloration des cellules ES maintenu avec SC1 ou FRV (figure 4 de la note d'application). Cellules maintenues en SC1 montrent similaires expression du marqueur de pluripotence des cellules maintenues en FRV.
Tableau 1
| Contrôle négatif | FRV contrôle positif | SC1 1um | SC1 300 nM | SC1 100 nM | |
| 1er passage | Normal la morphologie de cellules ES | Normal la morphologie de cellules ES | Normal la morphologie de cellules ES | Normal la morphologie de cellules ES | Normal la morphologie de cellules ES |
| Passage deuxième | Certains morphologie différenciée | E normaleMorphologie cellulaire S | Normal la morphologie de cellules ES | Normal la morphologie de cellules ES | Normal la morphologie de cellules ES |
| Passage 3e | La majorité des cellules différenciées | Normal la morphologie de cellules ES | Normal la morphologie de cellules ES | Normal la morphologie de cellules ES | Normal la morphologie de cellules ES |
| Passage quatrième | Pas de colonies ESC | Normal la morphologie de cellules ES | La mort cellulaire observée | Normal la morphologie de cellules ES | Normal la morphologie de cellules ES |
| 5th Passage | différenciés | Normal la morphologie de cellules ES | La mort cellulaire observée | Normal la morphologie de cellules ES | Normal la morphologie de cellules ES |
Discussion
Le SC1 petites molécules peuvent être utilisées pour maintenir l'auto-renouvellement d'un état indifférencié des cellules ES de souris. Avant d'utiliser sur une lignée cellulaire non testés, cependant, il devrait être titré pour déterminer la concentration optimale. Par exemple, nous avons testé trois concentrations sur la souris de lignée cellulaire ES R1 ESC. 100 nM et 300 nM concentrations ont été en mesure de maintenir les cellules ES de souris, cependant, une concentration de 1 uM était toxique.
SC1 peut également être utilisée sous alimentation sans conditions.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Ding Sheng du Scripps Research Institute et le Dr Deng Hongkui l'Université de Pékin pour leur aide et la direction.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SC1 | Stemgent | 04-0011 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| SSEA-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | 21702 | |
| Nanog antibody | Abcam | ab21603 | |
| Sox2 antibody | Chemicon International | Ab5603 | |
| Oct4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-5279 |
References
- Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).
