Summary
रास गैप और ERK1 की दोहरी निषेध के माध्यम से SC1 कार्य करता है. हम LIF के अभाव में माउस ES सेल आत्म नवीकरण के समर्थन में SC1 के समारोह का परीक्षण किया और पता चला कि SC1 माउस ES सेल संस्कृतियों का आत्म नवीकरण को बनाए रखने में सक्षम है.
Abstract
माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ते) पारंपरिक लेकिमिया निरोधात्मक (LIF) फैक्टर के लिए आत्म नवीकरण को बनाए रखने के साथ सुसंस्कृत हैं.
Protocol
1. MEF फीडर प्लेटों की तैयारी
- संवर्धन ES कोशिकाओं से पहले एक दिन, पिघलना एक की शीशी विकिरणित E14.5 CF-1 MEF फीडर कोशिकाओं (कैसे ES कोशिकाओं पिघलना के लिए हमारे प्रक्रिया देखें).
- प्लेट 10,000 कोशिकाओं के घनत्व में MEF फीडर कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली में. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रातोंरात कोशिकाओं सेते हैं. MEF सेल मीडिया: DMEM 10% ES - Pbs, 1X glutamine और 1X गैर आवश्यक अमीनो एसिड के साथ पूरक है.
2. माउस ES कोशिकाओं के आत्म नवीकरण का रखरखाव
- ES कोशिकाओं का उपयोग trypsin अलग. बीज / विकास मीडिया में पहले से तैयार MEF फीडर प्लेटें (15% KSR, 4 मिमी एल - glutamine, 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड और BME 1X के साथ पूरक नॉकआउट सदस्य) पर अच्छी तरह से 50,000 कोशिकाओं के घनत्व में कोशिकाओं SC1 के साथ पूरक वांछित एकाग्रता में (हम 100 एनएम, 300 एनएम, और एक सुक्ष्ममापी करते थे). हम भी एक सकारात्मक अच्छी तरह से नियंत्रण है कि 1000 μ / LIF के मिलीलीटर के साथ पूरक किया गया था जोड़ा. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रातोंरात कोशिकाओं सेते हैं.
- संस्कृति 37 पर कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस और 5% प्रत्येक पारित होने में 3-4 दिनों के लिए सीओ 2 . ताज़ा हर 48 घंटे में मीडिया.
- पारित होने 1:10 से 1:15 trypsin साथ प्रारंभिक बोने घनत्व के रूप में एक समान घनत्व को बनाए रखने की कोशिकाओं. 5 मार्ग के बाद, कक्षों ठेठ pluripotency immunocytochemistry का उपयोग कर मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए जांच की जा सकती है.
3. Pluripotency मार्करों के Immunocytochemical परीक्षा
- कोशिकाओं धीरे पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
- कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 500 μl लगानेवाला के साथ कोशिकाओं को ठीक करें.
- कोशिकाओं धीरे पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
- कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 500 μl अवरुद्ध बफर के साथ गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक.
- विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के 250 μl (हम निम्नलिखित dilutions पर Nanog, Sox2, SSEA1, और Oct4 प्रयोग किया है: 1:500, 1:2000, 1:500, और 1:500) के साथ कोशिकाओं को सेते
- कोशिकाओं धीरे पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
- माध्यमिक एंटीबॉडी के 250 μl के साथ कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए सेते प्रकाश से दूर रखते हुए (हम गधा का इस्तेमाल किया विरोधी माउस Alexa Fluor के साथ संयुग्मित ® 555 1 में 1:2000 और गधा विरोधी खरगोश Alexa Fluor ® 488 के साथ संयुग्मित : 2000).
- कोशिकाओं धीरे पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
- पिछले धोने के लिए DAPI (अंतिम एकाग्रता 1 / μg मिलीलीटर) जोड़ें और 5 मिनट सेते नाभिक कल्पना.
- एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का विश्लेषण.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
1. आकृति विज्ञान के परिणाम:
माउस ES कोशिकाओं (ईएससी R1) या तो LIF या SC1 की उपस्थिति में MEF फीडर कोशिकाओं पर बड़े हो रहे थे एक undifferentiated राज्य में आत्म नवीकरण को बनाए रखने के लिए. बीतने के बाद दूसरा, भेदभाव LIF या SC1 (नकारात्मक नियंत्रण) के बिना कोशिकाओं में मनाया जा सकता है और 5 अंश के बाद अनिवार्य रूप से कोई undifferentiated कालोनियों मनाया गया. LIF (सकारात्मक नियंत्रण) इलाज कालोनियों 5 सेल मार्ग भर में एक undifferentiated राज्य में बने रहे. 300 एनएम या 100 एनएम की सांद्रता में SC1 के साथ इलाज किया कोशिकाओं को भी 5 अंश के बाद undifferentiated बने रहे, तथापि, कोशिकाओं चौथे पारित होने के बाद 1 सुक्ष्ममापी SC1 अनुभवी कोशिका मृत्यु के साथ इलाज किया. (अंजीर app नोट के 2) तालिका 1 रूपात्मक टिप्पणियों का सार.
2. Pluripotency मार्करों की अभिव्यक्ति
SSEA1 Nanog Oct4, और Sox2 के लिए माउस ES 5 मार्ग के लिए बनाए रखा कोशिकाओं तय की और थे immunocytochemistry द्वारा जांच की. मार्कर अभिव्यक्ति LIF में बनाए रखा कोशिकाओं के समान था. (3 अंजीर और app नोट के 4)
चित्रा 1: LIF या SC1 में बनाए रखा कोशिकाओं की आकृति विज्ञान की तुलना . आकारिकी में कोई अंतर मनाया गया.
चित्रा 2 और चित्रा 3: Nanog, SSEA1, Sox2, और ES SC1 या LIF (अंजीर app नोट के 4) के साथ बनाए रखा कोशिकाओं के Oct4 धुंधला हो जाना . SC1 कक्ष में बनाए रखा LIF में बनाए रखा कोशिकाओं को इसी तरह pluripotency मार्कर अभिव्यक्ति दिखाओ.
तालिका 1
| नकारात्मक नियंत्रण | LIF सकारात्मक कंट्रोल | SC1 1um | SC1 300 एनएम | SC1 100 एनएम | |
| 1 पारित | सामान्य ES सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी |
| 2 पारित | कुछ विभेदित आकारिकी | सामान्य ईएस सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी |
| 3 पारित | विभेदित कोशिकाओं के अधिकांश | सामान्य ES सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी |
| 4 पारित | कोई ईएससी कालोनियों | सामान्य ES सेल आकारिकी | कोशिका मृत्यु मनाया | सामान्य ES सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी |
| 5 पारित | विभेदित | सामान्य ES सेल आकारिकी | कोशिका मृत्यु मनाया | सामान्य ES सेल आकारिकी | सामान्य ES सेल आकारिकी |
Discussion
छोटे अणु SC1 के लिए माउस ES कोशिकाओं में एक undifferentiated राज्य के साथ आत्म नवीकरण को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक untested सेल लाइन पर उपयोग करने से पहले, तथापि, यह करने के लिए इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण titrated होना चाहिए. उदाहरण के लिए, हम माउस ES सेल लाइन ईएससी R1 पर तीन सांद्रता का परीक्षण किया. 100 एनएम और 300 एनएम सांद्रता माउस ES कोशिकाओं को बनाए रखने में सक्षम थे, लेकिन एक 1 सुक्ष्ममापी एकाग्रता विषाक्त था.
SC1 भी फीडर मुक्त शर्तों के तहत इस्तेमाल किया जा सकता है.
Disclosures
इस लेख के लेखक Stemgent द्वारा नियोजित है कि अभिकर्मकों और इस लेख में इस्तेमाल उपकरणों का उत्पादन कर रहे हैं.
Acknowledgments
लेखकों के लिए उनकी सहायता और दिशा के लिए स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट के डॉ. शेंग डिंग और पीकिंग विश्वविद्यालय के डॉ. Hongkui देंग धन्यवाद इच्छा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SC1 | Stemgent | 04-0011 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| SSEA-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | 21702 | |
| Nanog antibody | Abcam | ab21603 | |
| Sox2 antibody | Chemicon International | Ab5603 | |
| Oct4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-5279 |
References
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- Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).
