Summary
Sinds James Thomson et al. ontwikkelde een techniek in 1998 te isoleren en HES groeien in de cultuur, hebben vriescellen voor later gebruik en ontdooien en uitbreiden van cellen van een ingevroren voorraad belangrijk geworden procedures uitgevoerd in routine hES celkweek. Omdat hES-cellen zijn zeer gevoelig voor de stress van het invriezen en ontdooien, speciale aandacht genomen. Hier laten we zien de juiste techniek voor het snel ontdooien van hES cellen van vloeibare stikstof voorraden, plating ze op de muis embryonale feeder-cellen, en langzaam invriezen voor langdurige opslag.
Abstract
Sinds James Thomson
Protocol
1. Ontdooien hES cellen
Pre-experimentele set-up
- Een dag voorafgaand aan het ontdooien hES cellen, plaat een voedingsbodem van bestraalde muis embryonale fibroblasten (MEF), CF1 stam, op een goed van een gelatine-gecoate 6-well weefselkweek plaat in MEF kweekmedium (D-MEM basaal medium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd FBS en 1% niet-essentiële aminozuren). Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Voordat u de hES cellen van vloeibare stikstof, moet u alle benodigde apparatuur en reagentia zijn in plaats en klaar voor gebruik om een efficiënte en succesvolle dooi te verzekeren.
Ontdooien van de hES cellen
- Verwijderen van een cryogene flacon van hES cellen van de vloeibare stikstof opslag tank met behulp van metalen tang.
- Rol de flacon tussen gehandschoende handen gedurende 3-5 seconden ingedrukt om de vorst te verwijderen.
- Noteer de gegevens op het etiket van de flacon.
- Met behulp van metalen tang, dompel de flacon in een 37 ° C waterbad. Zwenk de flacon voorzichtig en vaak houden aan de voortgang van de dooi (maar snel!) Door houden de flacon tegen het licht om de grootte van het ijs kristal. Niet onderdompelen de dop van de flacon in het waterbad, omdat dit zou kunnen verontreinigen van de cellen.
- Wanneer slechts een klein ijskristal blijft, dompel de gehele flacon in ethanol om te steriliseren.
- In een steriele biologische veiligheid kast, breng de inhoud van de cryogene flacon direct naar de bodem van een 15 ml conische buis.
- Voeg langzaam 4 mL van hES celkweekmedium (D-MEM/F-12 basaal medium aangevuld met 20% Knockout serum vervanging, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% L-glutamine, 0,2% β-mercapto-ethanol en 4 ng / mL bFGF) op de buis. Schud om voortdurend mixen de cellen als het nieuwe medium wordt toegevoegd aan de buis.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 x g.
Plating de HES Cellen
- Terwijl de hES cellen in de centrifuge, de voorbereiding van de MEF feeder plaat door middel van etikettering met de juiste hES cell informatie: cellijn, passage nummer, en ontdooien datum.
- Wanneer er sprake is ongeveer 2 minuten op de spin tijd, zuigen de MEF kweekmedium en voeg 1,0 mL PBS aan de put.
- Breng het ingehulde hES cellen om de biologische veiligheid kabinet, en zorgvuldig aspireer het supernatant. Wees voorzichtig niet naar de cel pellet aspireren, maar verwijder zoveel supernatant als mogelijk, omdat deze oplossing bevat DMSO uit de bevriezing medium.
- Resuspendeer de pellet heel voorzichtig door het toevoegen van 2,5 mL van HES celkweekmedium met behulp van een 5 ml glazen pipet en pipetteren 3-4 keer.
- Zuig het PBS van de MEF feeder goed en langzaam alle 2,5 mL van de HES celsuspensie toe te voegen aan de voorbereide goed van de 6-wells plaat.
- Plaats de plaat in de 37 ° C incubator en zorgvuldig de plaat naar voren naar achteren en opzij schuif naar rechts gelijkmatig te verdelen de cellen gedurende de put. Niet krul de plaat in een cirkelvormig patroon om te voorkomen dat het concentreren van de kolonies in het centrum.
- Laat de cellen te hechten bij 37 ° C en 5% CO 2 's nachts.
- De dag na de dooi, verwijder het medium (met een drijvend cellen) en voeg 2,5 ml vers hES celkweekmedium naar de waterput.
- Optioneel: De verwijderde medium en cellen kunnen worden overgebracht naar een afzonderlijk bereid MEF feeder plaat. Deze stap levert vaak nieuwe kolonies die kunnen worden gekweekt in parallel met cellen van de oorspronkelijke dooi.
- Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO 2 's nachts.
2. Het bevriezen van de hES cellen
- Terwijl de hES cellen in de centrifuge, het etiket van de cryogene flacons in de biologische veiligheid kabinet, inclusief de cellijn, passage nummer, en invriezen datum. De typische dichtheid voor het bevriezen van hES cellen is een bron van cellen (van een 6-wells plaat) per cryogene flacon.
- Wanneer de hES cellen klaar centrifugeren, terug te brengen van de buizen naar de biologische veiligheid kabinet. Zuig het supernatans van de buis, zorg dat u de los-packed cell pellet te verstoren.
- Resuspendeer de celpellet met de juiste hoeveelheid van HES celkweekmedium: 0,5 ml hES celkweekmedium per cryogene flacon. Wees zeer voorzichtig bij het pipetteren, zoals de hES cellen beter herstellen wanneer ingevroren in relatief grote kolonie stukken.
- Langzaam, terwijl zachtjes de buis te schudden, voeg de juiste hoeveelheid (0,5 ml per cryovial) van 2X hES cell bevriezing medium (60% gedefinieerd FBS, 20% hES celkweekmedium, en 20% DMSO) naar de cellen. Zodra de bevriezing medium wordt toegevoegd, de oplossing pipet uiterst voorzichtig een tot twee keer om te mixen.
- Snel, maar zacht, voeg 1 ml van de celsuspensie aan elke cryogene flacon.
- Breng de injectieflacons in een isopropanol bevriezing container en plaats in deeen -80 ° C vriezer gedurende de nacht. De cellen zullen bevriezen op 1 ° C per minuut in de isopropanol bevriezing container.
- De volgende dag, snel overdracht van de bevroren flesjes naar een vloeibare stikstof opslagtank met metalen tang.
Representatieve resultaten
De eerste dag na menselijke embryonale stamcellen ontdooid zijn, kunnen kleine kolonies lijken transparant en kan moeilijk te zien onder de microscoop. Omdat nieuw ontdooid ES-cellen hebben de neiging om langzaam te verspreiden, kunnen zij een paar dagen te verschijnen, zoals vastgesteld kolonies (figuur 1).
Figuur 1. Cel herstel en groei. HES cellen ontdooid van vloeibare stikstof werden afgebeeld 1, 7 en 11 dagen na het ontdooien.
Discussion
De bijhorende video toont een methode voor het ontdooien en invriezen hES cellen. Cellen ingevroren in vloeibare stikstof moet worden ontdooid bad zo snel mogelijk om de best mogelijke herstel te verkrijgen. Vergeet niet om uiterst voorzichtig bij het pipetteren ontdooien cellen: een minimum te beperken behandeling van de cellen en pipet voorzichtig. Een flacon van hES cellen kan worden uitgeplaat op beide een goed van een 6-well plaat, of ieder putje van een 4-wells plaat en onmiddellijk geplaatst in de incubator. Sinds kweken in vier afzonderlijke putten verkleint de kans op verlies van de hele cultuur van verontreiniging, en maakt het gemakkelijker te vinden hES cell kolonies op de kleinere oppervlakte, is de 4-wells plaat aanbevolen wanneer ontdooien hES cellen voor de eerste keer.
De eerste dagen na het ontdooien hES cellen, kolonies zijn klein en kunnen transparant zijn. Vul de HES celkweekmedium elke dag, zelfs als de koloniën niet zichtbaar zijn onder de microscoop, omdat het kan een paar dagen in cultuur hES cellen te verschijnen als gevestigde kolonies. Het is belangrijk om een vers plated MEF feeder layer gebruiken bij het ontdooien cellen, zoals de koloniën vaak een passende omvang niet bereiken voor passage tot 10 12 dagen na de dooi.
Bij het ontdooien een lage passage flacon van hES cellen, is het een goede gewoonte om uit te breiden en te bevriezen voor extra flesjes met een voorraad van lage passage cellen voor de toekomstige cultuur en experimenten te houden. Het is ook een goed idee om regelmatig bevriezen alle "extra" gezonde hES cellen op bevroren voorraden aan te houden. De meest succesvolle ontdooit en de daaropvolgende culturen zijn bevroren als van hoge kwaliteit, ongedifferentieerde, actief delende cel hES kolonies. hES cellen te herstellen van een bevriezing efficiënter als voorzichtig behandeld als een grotere cel aggregaten. De uiteindelijke totale grootte moet gelijk zijn aan (of iets groter dan), de grootte van de aggregaten plated na een routine-passage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2560 | For freezing medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5000-1020 | 1.5 mL capacity |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | Mr. Frosty” |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
