Summary
Seit James Thomson et al eine Technik entwickelt, im Jahr 1998 zu isolieren und zu wachsen hES in Kultur, haben Einfrieren von Zellen für die spätere Verwendung und Auftauen und Ausbau von Zellen aus einem gefrorenen Lager zu wichtigen Verfahren in der Routine-hES-Zell-Kultur durchgeführt. Da hES-Zellen sehr empfindlich auf die Belastungen von Einfrieren und Auftauen sind, ist besondere Sorgfalt. Hier zeigen wir die richtige Technik für die schnelle Auftauen hES-Zellen aus flüssigem Stickstoff Aktien, Plattieren sie auf embryonalen Feeder-Zellen, und langsam Einfrieren für die langfristige Lagerung.
Abstract
Seit James Thomson
Protocol
1. Auftauen hES-Zellen
Pre-experimentellen Set-up
- Einen Tag vor dem Auftauen hES-Zellen, Platte eine Feeder-Schicht von bestrahlten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF), CF1-Stamm, auf der einen sowie einer Gelatine-beschichteten 6-well Gewebekulturplatten in MEF Kulturmedium (D-MEM Basalmedium, ergänzt mit 10% Hitze-inaktiviertes FBS und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren). Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Vor dem Entfernen der hES-Zellen aus flüssigem Stickstoff, achten Sie darauf, alle notwendigen Geräte und Reagenzien verfügen und bereit zu verwenden, um eine effiziente und erfolgreiche Tauwetter zu gewährleisten.
Das Auftauen der HES-Zellen
- Entfernen eines Kryodosen von hES-Zellen aus dem flüssigen Stickstoff Lagerbehälter mit Metall Pinzette.
- Rollen Sie die Durchstechflasche zwischen behandschuhten Händen für 3-5 Sekunden, um den Frost zu entfernen.
- Notieren Sie sich die Angaben auf dem Etikett der Durchstechflasche.
- Mit Metall-Pinzette, tauchen Sie das Fläschchen in eine 37 ° C Wasserbad. Schwenken Sie die Durchstechflasche vorsichtig und beobachten den Fortschritt der Schneeschmelze oft (aber schnell!), Indem Sie die Flasche gegen das Licht, um die Größe der Eiskristalle zu sehen. Tauchen Sie den Deckel der Flasche im Wasserbad, da dies die Zellen verunreinigen könnten.
- Wenn nur ein kleiner Eiskristall bleibt, tauchen die ganze Flasche in Ethanol zu sterilisieren.
- In einer sterilen Sicherheitswerkbank, übertragen Sie die Inhalte der Kryodosen direkt auf den Boden eines 15 ml konischen Rohr.
- Langsam 4 ml hES-Zell-Kulturmedium (D-MEM/F-12 Basalmedium mit 20% Knockout Serumersatz, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 1% L-Glutamin, 0,2% β-Mercaptoethanol und 4 ng / ergänzt mL bFGF) auf das Rohr. Schütteln Sie ständig mischen die Zellen als das neue Medium in das Röhrchen gegeben wird.
- Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 Minuten bei 200 x g.
Plating der HES-Zellen
- Während die hES-Zellen in der Zentrifuge werden, bereiten die MEF Feeder Platte durch Kennzeichnung mit der entsprechenden hES-Zell-Informationen: Zell-Linie, Passage-Nummer und Tauwetter date.
- Wenn es etwa 2 Minuten auf die Spin-Zeit bleibt, saugen Sie den MEF Kulturmedium und 1,0 ml PBS, um den Brunnen.
- Bringen Sie die pelletierten hES-Zellen zurück, um die biologische Sicherheitswerkbank und sorgfältig absaugen des Überstandes. Achten Sie darauf, das Zellpellet absaugen, sondern entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, da diese Lösung enthält DMSO aus dem Einfriermedium.
- Re-suspend das Pellet sehr sanft durch Zugabe von 2,5 mL der hES-Zell-Kulturmedium mit einer 5 ml Glaspipette und Pipettieren 3-4 mal.
- Saugen Sie das PBS aus dem MEF feeder gut und langsam alle 2,5 mL der hES-Zell-Suspension auf die gut vorbereitet an den 6-Well-Platte.
- Legen Sie die Platte in die 37 ° C Inkubator und vorsichtig die Platte nach vorne nach hinten und seitlich zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen im ganzen gut. Nicht wirbeln die Platte in einem kreisförmigen Muster zu vermeiden, konzentriert sich die Kolonien in der Mitte.
- Lassen Sie die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht befestigen.
- Am Tag nach der Schneeschmelze, entfernen Sie das Medium (mit allen schwimmenden Zellen) und 2,5 ml frischer hES Zellkulturmedium zum Brunnen.
- Optional: Der entfernte Medium und Zellen können in eine separate vorbereitet MEF Feeder Platte übertragen werden. Dieser Schritt führt häufig zu neuen Kolonien, die parallel mit Zellen aus dem ursprünglichen Tauwetter kultiviert werden können.
- Die Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht.
2. Das Einfrieren der HES-Zellen
- Während die hES-Zellen in der Zentrifuge werden, beschriften Sie die Kryoröhrchen im biologischen Sicherheitsschrank, einschließlich der Zell-Linie, Passage-Nummer und das Einfrieren date. Die typische Dichte für das Einfrieren von hES-Zellen ist eine gut von Zellen (aus einer 6-Well-Platte) pro Kryodosen.
- Wenn der hES-Zellen fertig sind Zentrifugieren, bringen die Rohre zurück in den biologischen Sicherheitswerkbank. Saugen Sie den Überstand aus der Tube, dass Sie nicht die lose verpackt Zellpellet stören.
- Zellpellet mit der entsprechenden Menge von hES-Zell-Kulturmedium: 0,5 mL hES-Zell-Kulturmedium pro Kryodosen. Seien Sie sehr vorsichtig vorgehen, wenn Pipettieren, wie die hES-Zellen besser zu erholen, als in relativ große Kolonie Stücke eingefroren.
- Langsam, unter leichtem Schütteln der Röhre, fügen Sie die entsprechende Menge (0,5 ml pro Kryoröhrchen) von 2X hES-Zell-Einfriermedium (60% definiert FBS, 20% hES-Zell-Kulturmedium und 20% DMSO) zu den Zellen. Sobald die Einfriermedium zugegeben, die Lösung pipet äußerst schonend 1.59 mal zu mischen.
- Schnell, aber vorsichtig, geben Sie 1 ml der Zellsuspension auf jeweils Kryodosen.
- Übertragen Sie die Flaschen in einem Isopropanol Gefrierbehälter und ineiner -80 ° C Tiefkühltruhe über Nacht. Die Zellen werden bei 1 ° C pro Minute in das Isopropanol Gefrierbehälter einfrieren.
- Am folgenden Tag, schnelle Übertragung der eingefrorenen Ampullen zu einem flüssigen Stickstoff Lagerbehälter mit Metall Pinzette.
Repräsentative Ergebnisse
Am ersten Tag nach menschlichen ES-Zellen aufgetaut werden, können kleine Kolonien erscheinen transparent und schwierig sein kann, unter dem Mikroskop zu sehen. Da neu aufgetaut ES-Zellen zu langsam vermehren neigen, können sie ein paar Tage dauern als etablierte Kolonien (Abbildung 1) erscheinen.
Abbildung 1. Erholung der Zellen und Wachstum. HES-Zellen aus flüssigem Stickstoff aufgetaut wurden abgebildet 1, 7 und 11 Tage nach dem Auftauen.
Discussion
Das dazugehörige Video zeigt ein Verfahren zum Auftauen und Einfrieren hES-Zellen. Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren werden sollten, Bad so schnell wie möglich aufgetaut werden, um die bestmögliche Verwertung zu erreichen. Denken Sie daran, äußerst vorsichtig sein, beim Pipettieren Auftauen von Zellen: Minimierung Handling der Zellen und Pipette vorsichtig. Eine Durchstechflasche mit hES-Zellen können entweder auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, oder alle Wells einer 4-Well-Platte beschichtet werden und sofort in den Inkubator gestellt. Da Kultivierung in vier getrennten Wannen reduziert die Möglichkeit des Verlusts der gesamten Kultur, um eine Kontamination und macht es einfacher, hES-Zell-Kolonien auf der kleineren Fläche zu finden, ist das 4-Well-Platte empfohlen, wenn Auftauen hES-Zellen für die erste Zeit.
Der erste Tag nach dem Auftauen hES-Zellen werden die Kolonien klein und kann transparent sein. Tanken die hES-Zell-Kulturmedium jeden Tag, auch wenn die Kolonien nicht unter dem Mikroskop sichtbar, da es ein paar Tage in Kultur für hES-Zellen kann als etablierte Kolonien erscheinen. Es ist wichtig, ein frisch vergoldet MEF Feeder-Schicht zu verwenden, wenn Auftauen von Zellen, wie die Kolonien, oft nicht erreichen eine angemessene Größe für die Passage bis 10 12 Tage nach der Schneeschmelze.
Beim Auftauen einen niedrigen Gang Fläschchen hES-Zellen, ist es gute Praxis zu erweitern und zu frieren zusätzliche Fläschchen auf einen Bestand von niedrigen Durchgang Zellen für zukünftige Kultur und Experimente zu erhalten. Es ist auch eine gute Idee, regelmäßig freeze all "extra" gesunde hES-Zellen eingefroren Aktien zu halten. Die erfolgreichsten auftaut und nachfolgende Kulturen wurden als hochwertige, undifferenzierten, sich aktiv teilenden hES-Zell-Kolonien eingefroren. hES-Zellen aus einem Einfrieren effizienter wiederherzustellen, wenn sanft wie größere Zellaggregate behandelt. Die endgültige Körnung sollte ähnlich (oder etwas größer als) die Größe der Aggregate nach einer Routine-Passage überzogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2560 | For freezing medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5000-1020 | 1.5 mL capacity |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | Mr. Frosty” |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
