Summary
제임스 톰슨 외 문화에 hES을 분리하고 성장 1998 년 기술을 개발 때문에, 나중에 사용하기 위해 및 냉동 주식에서 세포를 해동 및 확대 냉동 세포는 일상 hES 세포 배양에서 수행한 중요한 절차가있다. hES 세포는 동결 융해의 스트레스에 민감하고 있으므로 특별한주의가 있어야합니다. 여기 우리는 신속하게, 액체 질소 주식에서 hES 세포를 해동 마우스 배아 피더 세포를 도금하고, 천천히 장기 저장을 위해 그들을 오해해서 적절한 방법을 보여줍니다.
Abstract
제임스 톰슨 이후
Protocol
1. 해동 hES 세포
사전 실험 설정
- 하루 전에 해동 hES 세포로, 플레이트 MEF 문화 매체에 젤라틴 코팅 6 잘 조직 배양 플레이트 (D - 멤 기초 매체와 보충 잘 하나에 조사 마우스 배아 섬유아 세포 (MEF), CF1 변형의 피더 층 10% 열 inactivated FBS, 1 %가 아닌 필수 아미노산). 37 밤새 품어 ° C와 5% CO 2.
- 액체 질소에서 hES 세포를 제거하기 전에, 장소에 필요한 모든 장비와 시약을 가지고 있는지 확인하고 효율적이고 성공적으로 해동을 위해 사용할 수 있습니다.
hES 세포를 해동
- 금속 집게를 사용하여 액체 질소 저장 탱크에서 hES 세포의 극저온 약병을 제거합니다.
- 서리를 제거하는 3-5초 위해 장갑 낀 손 사이의 병을 롤.
- 유리병의 라벨에 정보를 기록합니다.
- 금속 집게를 사용하여 37 ° C의 물 목욕으로 병을 담가. 소용돌이 부드럽게 유리병과 얼음 결정의 크기를 확인하기 위해 조명에 병을를 개최하여 (그러나 빨리!) 자주 해동의 진행을 관찰. 잠수함 물 목욕에있는 유리병의 뚜껑을이 세포를 오염시킬 수 있으므로하지 마십시오.
- 단지 작은 얼음 결정이 남아 잠수함 소독에 에탄올의 전체 유리병.
- 무균 생물 학적 안전 캐비닛에서 직접 15 ML 원뿔 관의 하단에 극저온 약병의 내용을 전송합니다.
- 천천히 hES 세포 배양 매체 4 ML (D-MEM/F-12 기초 매체 20 % 넉아웃 혈청 교체, 1 %가 아닌 필수 아미노산, 1 % L - 글루타민, 0.2 % β - 메르 캅 토 에탄올과 4 NG /로 보충을 추가 튜브에 ML bFGF). 부드럽게 새로운 매체가 튜브에 추가로 지속적으로 세포를 섞어 바위.
- 200 X G.에서 5 분 동안 세포를 원심 분리기
hES 세포를 도금
- 셀 라인 통로 번호 및 해동 날짜 : hES 세포는 원심 분리기에있는 동안, 해당 hES 세포 정보를 라벨로 MEF 피더 플레이트를 준비합니다.
- 스핀 시간에 남아있는 약 2 분이되면, MEF 문화 매체를 대기음하고 잘하는 PBS의 1.0 ML를 추가합니다.
- 생물 학적 안전 캐비닛 다시 pelleted hES 세포를 가지고, 그리고 신중하게 뜨는을 대기음. 이 솔루션은 냉동 매체에서 DMSO가 들어 있으므로 세포 펠렛을 대기음지만, 가능 한한 많이 뜨는 제거하지 않도록주의하십시오.
- 펠렛은 5 ML 유리 pipet을 사용하여 hES 세포 배양 매체 2.5 ML를 추가하고 3-4 회를 pipetting하여 매우 부드럽게 다시 일시 중지합니다.
- 잘 MEF 피더에서 PBS를 대기음 천천히 6 잘 접시 잘 준비에 hES 세포 현탁액의 2.5 ML를 추가합니다.
- 37 ° C 배양기에 접시를 놓고 신중하게 고르게 잘 내내 세포를 배포하는쪽으로 뒤로 앞으로 판과 측면을 슬라이드. 중앙의 식민지를 집중 방지하기 원형 패턴에 소용돌이 접시를하지 마십시오.
- 세포 ° C와 5% CO 2 밤새 37 첨부할 수 있습니다.
- 해동 후 하루 매체를 제거합니다 (임의의 부동 세포)와 잘 신선한 hES 세포 배양 매체 2.5 ML를 추가합니다.
- 옵션 : 중간 제거하고 세포가 별도의 준비 MEF 피더 플레이트로 전송하실 수 있습니다. 이 단계는 종종 원래 해동의 세포와 병렬로 양식 수있는 새로운 식민지를 생성합니다.
- 37 ° C와 5% CO 2 밤새에서 접시를 품어.
2. hES 세포를 동결
- hES 세포는 원심 분리기에있는 동안, 세포 라인 통로 번호 및 동결 기간을 포함한 생물 학적 안전 캐비닛 내부의 극저온 튜브를 라벨. 냉동 hES 세포에 대한 전형적인 밀도는 극저온 유리병 당 세포 (6 잘 판에서) 잘 하나입니다.
- hES 세포가 centrifuging 완료되면, 생물 안전 캐비닛 다시 튜브를 가져와. 느슨하게 - 포장 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하고, 튜브의 표면에 뜨는를 대기음.
- 극저온 유리병 당 0.5 ML hES 세포 배양 매체 : hES 세포 배양 매체의 적절한 금액으로 세포 펠렛을 Resuspend. 비교적 큰 콜로니 조각에 얼어 붙 때 hES 세포보다 회복으로, pipetting 할 때 조심.
- 천천히, 부드럽게 튜브를 흔들어 동안 세포 2X hES 세포 냉동 매체 (60 % 정의된 FBS, 20 % hES 세포 배양 매체, 20 % DMSO)의 적절한 금액 (cryovial 당 0.5 ML)를 추가합니다. 일단 냉동 매체 pipet 믹스에 1-2 시간은 매우 부드럽게, 솔루션에 추가됩니다.
- 신속하게하지만 천천히, 각 극저온 약병에 세포 현탁액 1 ML를 추가합니다.
- 에 이소프로판올 냉동 컨테이너와 장소에 튜브를 전송하룻밤 -80 ° C 냉동고. 세포는 1 ° C 이소프로판올 냉동 컨테이너에 분당 정지됩니다.
- 그 다음날, 신속하게 금속 집게를 사용하여 액체 질소 저장 탱크에 냉동 튜브를 전송합니다.
대표 결과
인간 ES 세포를 해동하는 첫째날 이후 작은 식민지가 투명하게 나타날 수 있고 현미경으로 볼 수 어려울 수 있습니다. 새로 해동 ES 세포가 서서히 분아 따위에 의해 번식하는 경향이 있기 때문에, 그들은 식민지 설립 (그림 1)로 표시 며칠이 걸릴 수 있습니다.
그림 1. 핸드폰 복구 및 성장. hES 세포 액체 질소에서 해동이 몇 군데 있었다 1, 7 11일 해동 후.
Discussion
함께 비디오 hES 세포를 해동 및 냉동하는 방법을 보여줍니다. 액화 질소에 냉동 세포는 최상의 복구를 얻기 위해 최대한 빨리 목욕을 해동한다. 해동 세포를 pipetting 할 때 매우 조심해야하는 기억 세포의 취급을 최소화하고 부드럽게 피펫. hES 세포 중 하나 유리병은 6 자 판, 또는 4 자 판의 모든 우물을 잘 둘 중 누구에 도금 즉시 인큐베이터에 배치하실 수 있습니다. 네 별도의 우물에 culturing은 오염에 대한 전체 문화를 잃는의 가능성을 감소하고, 쉽게 작은 표면적에 hES 세포 식민지를 찾을 수 있습니다 이후 처음으로 hES 세포를 해동하면, 4 - 음 판을 권장합니다.
hES 세포를 해동 후 첫날, 식민지 작은 있으며, 투명 수 있습니다. 그것이 설립 식민지로 표시 hES 세포에 대한 문화에 며칠이 걸릴 수 있습니다 이후 식민지가 현미경으로 명확하지 않더라도, 매일 hES 세포 배양 매체를 보충. 식민지가 자주 해동 후 10 12일까지 passaging에 적절한 크기에 도달하지 않으면 그것은 세포를 해동하면 갓 도금 MEF 피더 레이어를 사용하는 것이 중요합니다.
hES 세포의 낮은 통로의 약병을 해동하면, 그것은 미래의 문화와 실험에 대한 낮은 통과 세포의 재고를 유지하기 위해 추가 튜브를 확장하고 동결하는 것이 좋습니다. 또한 정기적으로 냉동 주식을 유지하기 위해 모든 "추가"건강한 hES 세포를 동결하는 것이 좋습니다. 가장 성공적인 녹아서 이후 문화는 고품질, undifferentiated, 적극적으로 나누어 hES 세포 식민지로 동결했다. 큰 세포 집계로 부드럽게 처리하는 경우 hES 세포가보다 효율적으로 정지에서 복구합니다. 최종 집계 크기는 일상적인 통로 후 도금 집계의 크기 (또는보다 약간 큰)과 유사해야합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
| D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | Type A, Porcine |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2560 | For freezing medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | Hyclone | SH300.70.01 | For freezing medium |
| 6-well plates | Nalge Nunc international | 140675 | For general culture |
| 4-well plates | Nalge Nunc international | 176740 | For thawing |
| 5 mL glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-27E | Individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene |
| Cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5000-1020 | 1.5 mL capacity |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | Mr. Frosty” |
References
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , 5th edition, Wiley-Liss. (2005).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
