Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel

doi: 10.3791/1558 Published: November 23, 2009

Summary

O peixe-zebra maxilar barbo é um órgão do sentido tegumentar contendo ectodérmica, mesodérmica e derivados da crista neural. Importante, o barbo adulta consegue regenerar após a amputação proximal. Este vídeo apresenta o desenvolvimento barbel maxilar e demonstra um protocolo cirúrgico para induzir a regeneração, seguido por incorporação de coleta, ea jusante de imagens de espécimes barbos.

Abstract

Barbos são apêndices sensoriais da pele encontrados em peixes, répteis e anfíbios. O peixe-zebra, Danio rerio, desenvolve dois pares de barbos-um par de curto nasal e um par mais maxilar. Barbel tecido contém células de origem ectodérmica, mesodérmica e origem da crista neural, incluindo as células da pele, glândulas, papilas gustativas, os melanócitos, vasos circulatórios e nervos sensoriais. Diferentemente da maioria dos tecidos adultos, o barbo maxilar é opticamente clara, o que nos permite visualizar o desenvolvimento ea manutenção destes tipos de tecidos em todo o ciclo de vida.

Este vídeo mostra o desenvolvimento inicial do barbo maxilar (início cerca de um mês pós-fertilização) e demonstra um protocolo cirúrgico para induzir a regeneração no apêndice adultos (> 3 meses pós-fertilização). Resumidamente, o barbo maxilar esquerdo de um peixe é elevado anestesiados com pinças esterilizadas imediatamente distal à borda caudal da maxila. Uma multa, tesoura primavera estéril é posicionado contra a pinça para cortar o eixo do barbo, a este nível, estabelecendo um marco anatômico para o plano de amputação. Crescimento regenerativa pode ser medida com relação a este plano, e em comparação com o barbo contralateral. Barbel tecido se regenera rapidamente, atingindo regrowth máxima dentro de 2 semanas da lesão.

Técnicas de análise do barbo regeneradas incluem dissecar e incorporação de pares de barbos (regenerar e controle) nos poços de um gel de eletroforese de DNA padrão. Espécimes incorporados são convenientemente fotografados em um estereomicroscópio para a morfologia e morfometria bruta, e pode ser armazenado durante semanas antes de aplicações a jusante como histologia parafina, cryosectioning, e / ou imuno-histoquímica montar todo. Estes métodos estabelecer o barbo maxilar como um romance no sistema de tecido vivo para estudar a capacidade de regeneração dos vários tipos de células dentro do contexto genético de peixe-zebra.

Protocol

Zebrafish criação

Peixe-zebra são alojados e criados de acordo com métodos padronizados 1. Passado o período tardio larval, o estágio de desenvolvimento de um peixe-zebra pode ser medido pelo seu comprimento padrão (SL), ou a distância em linha reta em milímetros do ponto anteriormost do lábio superior para a base da nadadeira caudal (placa hypural posteriormost) 2. Em aproximadamente um mês após a fertilização (10-12 mm SL), o barbos nasal e maxilar aparecer como transparente brotos epiteliais perto do pits olfativa e nos cantos posterior da maxila, respectivamente. Como o peixe-zebra amadurece, a estender-se barbos estreito, whisker-como apêndices. Porque o barbo maxilar é maior (2-3 mm) e mais fácil de manipular, nosso protocolo aplica-se somente a este apêndice particular; técnicas semelhantes, no entanto, poderia ser adaptada para o menor nasal barbos.

Clipping Barbel

  1. Anestesiar zebrafish adulto na fase desejada (por exemplo., 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 meses pós-fertilização) por imersão em 0,015% MS-222 (3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato) tamponada a 7,0 pH em água do sistema. Observe os movimentos até parar de nadar e ventilação branquial torna-se lenta e regular. Dependendo do tamanho do peixe, anestesia completa demora cerca de 05/02 minutos.
  2. Usando um arrastão aquário, peixes de transferência de 1-3 em um momento de um pedaço dobrado de papel toalha molhada em uma placa de Petri. Usando uma espátula sem corte, orientar o peixe assim que são paralelos uns aos outro lado e lateral esquerdo para cima. Parte dobra da toalha de papel molhado sobre a parte caudal do peixe, cobrindo todo o corpo até o opérculo (guelra cobre) para manter a pele e as guelras úmidas durante o procedimento.
  3. Ver a placa de Petri sob estereomicroscópio, utilizando-se de baixo ângulo de luz incidente para iluminar a região da cabeça. Foco na base do barbo maxilar esquerdo, que se projeta a partir do canto posterior ventral da maxila (Fig. 1).
    Figura 1
    Figura 1.
  4. Firmemente segure o eixo do barbo ligeiramente para a extremidade distal da maxila. Elevar o eixo barbo e inserir as mandíbulas de uma tesoura de ponta fina de primavera apenas proximal ao fórceps. A tesoura pode ser tocado com a pinça para a estabilidade. Deslize as mandíbulas da tesoura ao longo do eixo do barbo até que a ponta se aproxima da borda da maxila. Fechar a tesoura para cortar através do eixo barbos. O barbo amputada, ainda agarrado na pinça, pode ser removido para a fixação ou observação posterior.
  5. Transferir imediatamente o peixe para um pequeno tanque de água sistema limpo (~ 500 mL) contendo uma gota de azul de metileno para controlar a infecção fúngica superficial. Permitir que o peixe se recuperar durante a noite. Na manhã seguinte, devolver o peixe para o sistema de criação. Barbel regeneração é máxima após 2 semanas.

Incorporação de Agar Pares Barbel

  1. Coletar peixes pela técnica apropriada a eutanásia e fixar em um tubo de 50 mL de paraformaldeído 4% tampão fosfato (PBS) com agitação a 4 ° C durante a noite. O volume de fixador deve ser pelo menos dez vezes o volume do tecido. Após a fixação, descarte de resíduos paraformaldeído em um recipiente aprovado e lavar o tecido completamente em diversas mudanças de PBS.
  2. Prepare em um mL de vidro 250 ml frasco 150 de 2% agarose (T m ~ 37 ° C) em água destilada. Calor com um microondas ou chapa quente, agitando periodicamente até que esteja completamente dissolvido. Equilibrar a solução fundida em um banho de água 50-60 ° C.
  3. Montar um equipamento de eletroforese em gel padrão, colocando um molde de gel vedado pequena (10 x 10 cm; ~ 100 mL de volume gel) firmemente contra os lados da câmara de buffer. Adicionar 2-4 pequena amostra pentes de dentes (4 x 1,5 mm).
  4. Sobre uma superfície plana, coloque a agarose derretida no molde para cobrir apenas a base dos favos, formando poços muito superficial. Imediatamente coloque a agarose sobra volta para o banho de água morna, que será usado posteriormente para incorporar o tecido (Passos 9-12). Coloque um copo longo Pasteur pipeta no frasco para manter a pipeta para a mesma temperatura que a agarose.
  5. Permita que o gel para endurecer por 20-30 minutos. Remover os favos, em seguida, retire o molde gel contendo o gel endurecido da câmara de buffer. Firmemente a fita lados abertos do molde gel com fita de laboratório para que o gel não deslize para fora. Esta fita deve se estender vários milímetros sobre a superfície do agarose para que agarose adicionais podem ser adicionados mais tarde (Passo 13).
  6. Posicione o molde de gel no palco de um estereomicroscópio. Ampliar um poço vazio e trazer as bordas em foco.
  7. Sobre a superfície do agarose ao lado do bem, pipetar uma gota de água ou tampão contendo os espécimes fixos barbo (por exemplo, regenerar, e controle). Using dobrados pinos de insetos, arraste as amostras úmidas para dentro do poço e empurrá-los para o fundo. Orientar o barbo eixos paralelos um ao outro e alinhados contra oposto bordas longas do poço. Tensão superficial vai ajudar a segurar o tecido na posição.
  8. Quando estiver pronto para incorporar, use uma ponteira fina ou o canto de um tecido de laboratório para remover o excesso de fluido do poço. Trabalhar rapidamente para não deixar o tecido secar.
  9. Usando a pipeta Pasteur de vidro aquecido, gentilmente pipeta fresco agarose derretida e em torno da espécimes para selar o tecido barbo no lugar. Não encha demais. Antes da agarose endurece, fazer adaptações de última hora com os pinos de insetos.
  10. Coloque uma etiqueta numerada exemplar de papel ao lado do bem e prenda-o com uma pequena gota de agarose.
  11. Repita os passos 6 a 10 para cada poço de espécimes.
  12. Se desejar para a calibração da imagem, inserir um pedaço de papel com uma escala micrométrica impressos (por exemplo, http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) no fundo de um poço vazio. Achatar o papel para o fundo do poço e cobri-lo com agarose quente.
  13. Depois de todos os espécimes são incorporados, a superfície do gel será irregular, com gotas de agarose endurecido. Coloque o gel sobre uma superfície plana e gentilmente despeje adicionais agarose derretida até a superfície superior é uniforme. Use a menor quantidade de agarose necessário para obter uma superfície lisa; muito agarose vai obscura de luz de transmissão fotografia. Permitir que esta camada superior para endurecer.
  14. O gel pode agora ser fotografado no palco de um estereomicroscópio para registrar morfologia bruta para cada par de barbo. Calibração da imagem é obtida por fotografar a escala micrométrica incorporado.
  15. O gel inteiro pode ser armazenado envolto em toalhas de papel molhado e selado em um saco plástico a 4 ° por várias semanas.
  16. Para posterior análise, blocos de ágar contendo par casado de barbos podem ser cortadas do gel com uma lâmina de bisturi ou navalha e processados ​​para exame histológico de parafina ou cryosectioning por métodos padrão 3,4. Alternativamente, barbos individuais podem ser dissecados fora da agarose com agulhas finas, lavadas em água, e processados ​​para outras aplicações a jusante (por exemplo, imuno-histoquímica todo-mount ou microscopia confocal).

Discussion

O peixe-zebra maxilar barbo é um sistema de tecido subutilizados para estudar o crescimento, manutenção e regeneração de vários tipos de células no zebrafish. Embora o apêndice barbel não tem analógico humanos, os tipos de células que contém são altamente conservadas, tornando possível o estudo da pele, glândulas, vasos melanócitos, circulatório e os nervos em uma estrutura opticamente clara e anatomicamente simples cilíndrico. Semelhante ao fin bem estudado caudal, tecido barbel podem ser induzidas a regenerar pela amputação. Usando a fronteira da maxila como um marco anatômico, o plano de amputação pode ser colocado com precisão, facilitando a medição de barbo rebrota. Para um operador experiente, cada cirurgia leva apenas alguns segundos. A recuperação é rápida, e nós temos até agora não detectaram efeitos a curto ou a longo prazo sobre o comportamento dos peixes. Peixe-zebra com um mergulho barbel maxilar, comer e raça de forma tão eficaz como controles não-cirúrgico, e têm a sobrevivência comparável ao momento da coleta de tecido, até 6 meses após a cirurgia. O impacto fisiológico da cirurgia prevista para ser mínimo, porque 1) o paladar extraoral transportados no barbo também são encontrados em muitas outras partes do epitélio de peixes, incluindo lábios, bochechas e cabeça 5, e 2) papilas gustativas diferenciar aparecem no o barbo regeneração dentro de 72 horas (LeClair et al., dados não publicados). Isso torna o barbo maxilar um sistema minimamente invasivo para estudar a cicatrização de feridas, a revascularização e reinervação no contexto de um vertebrado adulto.

Após a indução cirúrgica de regeneração, barbos podem ser coletados em intervalos de medição morfométricas e / ou análise microscópica do tecido fixo. Convenientemente, o barbo maxilar é aproximadamente o comprimento (2-3 mm) e diâmetro (100-200 mm) de um embrião de peixe-zebra, facilitando a aplicação de muitos protocolos padrão, incluindo histologia de parafina, cryosectioning, todo-mount imuno-histoquímica, e in situ hibridização. Em conjunto, estas características tornam o barbo maxilar altamente viável em modelo in vivo para estudar reparo e regeneração tecidual.

Acknowledgments

Estes métodos foram desenvolvidos por EEL durante uma licença de pesquisa no laboratório de Apoio JT foi fornecido pela Universidade DePaul Research Council e um NIH / NIDCR R01 conceder ao JT (DE016678). Agradecemos os esforços de Hunter Caroline, técnico de cuidados de animais nas instalações do núcleo zebrafish CMRC e Pawluczuk Paulina, a nossa assistente de laboratório de graduação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A stereo dissecting microscope with transmitted and incident fiber-optic illumination is required for barbel clipping and agar embedding
Fish system water
2 zebrafish crossing tanks
MS-222 (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate; Sigma Chemical #E10521-10G)
sterile 120-mm Petri plate
wet paper towels
blunt metal spatula
Dumont #55 Bio Inox Forceps (Fine Science Tools #11255-20)
Mini-Vannas spring scissors (Fine Science Tools #15000-00)
methylene blue antifungal agent (Drs. Foster & Smith #CD-905781)
small aquarium fishnet
4% paraformaldehyde in 1x phosphate-buffered saline (PF-PBS), aliquoted into 50 mL conical tubes and stored frozen at -20°C until use
1x phosphate-buffered saline (pH 7.27-6)
250 mL glass flask
2% agarose in distilled water
standard small agarose gel electrophoresis rig (gel size = ~10 cm square)
small-toothed electrophoresis sample comb (comb size 4 x 1.5 mm)
warm water bath (50-60°C)
laboratory tape
black enameled insect pins, size 000 (Fine Science Tools #26000-25)
1-2 pin holders (Fine Science tools #26016-12)
9-inch glass Pasteur pipette
pipette bulb or pump
laboratory tissue
small paper labels
(optional) printed calibration scale
wet paper towels
zip-closure plastic bag
scalpel/razor blade (to cut out agar blocks)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  2. Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
  3. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
  4. Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  5. Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).
Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

LeClair, E. E., Topczewski, J. Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel. J. Vis. Exp. (33), e1558, doi:10.3791/1558 (2009).More

LeClair, E. E., Topczewski, J. Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel. J. Vis. Exp. (33), e1558, doi:10.3791/1558 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter