Summary
Angiogenese ist die Sprossung der Blutgefäße aus bereits bestehenden Gefäßen, mit natürlichen und pathologischen Prozessen assoziiert. Hier zeigen eine Aorten-Ring-Test, dass angiogene Potentiatoren und Inhibitoren direkt an Aortenringen in Kultur hinzugefügt werden können. Sprouting und neovessel Auswuchs kann durch Einsicht in die Aortenringen über einen Zeitraum von 6-12 Tagen bestimmt werden.
Abstract
Angiogenese ist die Sprossung der Blutgefäße aus bereits vorhandenen Gefäßen mit natürlichen und pathologischen Prozessen assoziiert. Verschiedene Angiogenese Assays beinhalten die Untersuchung der einzelnen Endothelzellen in Kultur Bedingungen (1). Die Aorten-Ring-Test ist ein Angiogenese-Modell, das auf Organkultur basiert. In diesem Test wachsen angiogenen Gefäßen aus einem Segment der Aorta (modifiziert nach (2)). Kurz gesagt, Maus Aorta herausgeschnitten wird, werden die Fettschicht und Adventitia entfernt und Ringe ca. 1 mm in der Länge sind vorbereitet. Individuelle Ringe werden dann in einem kleinen festen Kuppel des Keller-Matrix-Extrakt (BME), in einzelnen Vertiefungen einer 48-Well-Platte gegossen eingebettet. Angiogenen Faktoren und Inhibitoren der Angiogenese kann direkt an den Ringen hinzugefügt werden, und eine gemischte Co-Kultur von Aorten-Ringe und andere Zelltypen können zur Untersuchung von parakrinen angiogenen Effekte eingesetzt werden. Sprouting wird durch Inspektion unter einem Stereomikroskop über einen Zeitraum von 6-12 Tagen beobachtet. Aufgrund der großen Variation von den Unregelmäßigkeiten in der Aorta Segmente, das Experimentieren in 6-Duplikate verursacht wird dringend empfohlen. Neovessel Auswuchs ist das ganze Experiment und bebildert mit Phasenmikroskopie überwacht und Überstände werden für die Messung der relevanten angiogenen und anti-angiogenen Faktoren, Zelltod-Marker und Nitrit gesammelt.
Protocol
Einen Tag vor dem Experiment:
- Lassen BME (ermäßigt Wachstumsfaktor, Cultrex, Trevigen) auf Eis oder bei 4 ° C auftauen; einmal aufgetaut halten auf Eis erneut festigen zu verhindern.
Tag des Experiments:
- Mäuse (6-7 Wochen alt) sind zu betäubt und ausgeblutet.
- Entfernen Aorta in eine Petrischale mit kaltem sterilem PBS gefüllt.
- Führen Sie eine mechanische Reinigung von umliegenden Fettgewebe. Beachten Sie, vermeiden Trocknung von Aorta ist jederzeit möglich.
- Mit einem Skalpell, Slice Aorta gleichmäßig in 1 mm Ringen. Der Schnitt muss gleichmäßig sein und sauber.
- Transfer-Ringen an die frische kalte PBS und halten auf Eis zu allen Zeiten.
- Mit vorgekühlten Pipettenspitzen, zu jedem Well hinzu in einer 48-Well-Platte einen runden Tropfen 150 ml kaltem BME. Lassen Sie die BME Tropfen bei 37 ° C erstarren für 20-30 Minuten.
- Legen Sie eine einzelne Aorten-Ring oben in der Mitte eines jeden Kuppel. Inkubieren für 10 Minuten bei 37 ° C.
- Am Anfang jeder Ring eine zusätzliche 150 ml BME. Inkubieren für 20-30 Minuten bei 37 ° C.
- Bereiten Medium: Human endothelial serumfreien Medium (Gibco, Carlsbad, CA) mit 2% FCS, 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin (CellGro) ergänzt.
- Zu jedem Well 500 ml Medium mit entweder:
- Experimentelle Proben.
- Positive Kontrolle: Endothelzellwachstum Ergänzung (EKG, Endkonzentration 200 ug / ml, BD Biosciences).
- Negative Kontrolle: Medium allein.
- Inkubieren Platte bei 37 ° C für 12 Tage, Foto Ringen zwischen den Tagen 6 und 12 unter Standard-Phasenkontrast Stereoskop.
- Optional: Collect Überstände.
Notes:
- Keep sterilen Bedingungen zu allen Zeiten.
- Vermeiden Einführung von Blasen in der BME.
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Discussion
Aorten-Ring-Test ist ein nützliches Hilfsmittel auf dem Weg zu evaluieren angiogenen und anti-angiogenen Faktoren. Die Schiffe, die aus wachsen Aortenringen rekrutieren glatten Muskelzellen und Perizyten mit den Endothelzellen Rohr verbinden, das heißt, sie anatomisch ähnlich neovessels in vivo sind. Darüber hinaus hält die Maus Aorten-Ring-Test den Vorteil der Vielzahl von transgenen Werkzeuge zur Verfügung für diese Spezies. Dennoch gibt es einige Nachteile bei der Aorten-Ring-Test. Zuerst tritt Schiffe Auswuchs in vivo aus Mikrogefäßen und nicht von den großen Gefäßen wie der Aorta. Zweitens Inkonsistenz in der Handhabung der Ringe und die Höhe des umliegenden Gewebes noch auf dem Schiff kann Einfluss Schiff Auswuchs. Ringe aus verschiedenen Aorten-oder anderen Mäusen das Alter und Stämme können auch mit dem angiogenen Reaktionen stören. Und schließlich tritt Angiogene Schiff Auswuchs in drei Dimensionen, die es nicht ideal zu fotografieren und zu quantifizieren ist. Zusammen genommen, wenn sie mit genügend internen Kontrollen und mit mehreren Wiederholungen durchgeführt wird, ist dieser Test relativ einfach, nicht teuer, sehr informativ und signifikant überlegen endothelialen Kulturen in ihrer biologischen Komplexität und Relevanz.
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References
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular Research. 74, 172-183 (2007).
- Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis. Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).
