אבי העורקים Assay טבעת

Summary

אנגיוגנזה, מצמיח כלי דם בכלי הדם קיימים, קשור גם בתהליכים טבעיים פתולוגי. כאן אנו מדגימים assay טבעת אבי העורקים המאפשר potentiators angiogenic ומעכבי להתווסף ישירות טבעות אבי העורקים בתרבות. להנבטה ו תולדה neovessel ניתן לקבוע באמצעות בדיקת מצלצל אבי העורקים על פני תקופה של 6-12 ימים.

Abstract

אנגיוגנזה, מצמיח כלי דם בכלי הדם preexisting קשורה בשני תהליכים טבעיים פתולוגי. מבחני אנגיוגנזה שונים לערב את המחקר בתאי האנדותל של הפרט בתנאים תרבות (1). Assay טבעת אבי העורקים הוא מודל אנגיוגנזה המבוסס על תרבות איברים. ב assay זה, כלי angiogenic לצמוח מתוך קטע של אבי העורקים (שונה מ - (2)). בקצרה, אבי העורקים החזי העכבר הוא נכרת, שכבת שומן adventitia מוסרים, וטבעות כ 1 מ"מ באורך מוכנים. טבעות אישיות המוטבעים אז בכיפה מוצק קטן של תמצית מרתף מטריקס (BME), יצוק בתוך בארות בודדים של צלחת 48-באר. גורמים angiogenic ו מעכבי אנגיוגנזה ניתן להוסיף ישירות את הטבעות, מעורבת שיתוף התרבות של טבעות אבי העורקים ואת סוגי תאים אחרים יכול להיות מועסק לחקר תופעות angiogenic אוטוקריני. להנבטה היא נצפתה על ידי בדיקה תחת stereomicroscope על פני תקופה של 6-12 ימים. בשל השונות הגדולה הנגרמת על ידי אי סדרים במגזרים אבי העורקים, ניסויים 6-plicates מומלץ בחום. תוצאה Neovessel מנוטר במהלך הניסוי צילמו באמצעות מיקרוסקופ שלב, ואת supernatants נאספים למדידת גורמים angiogenic ואנטי angiogenic רלוונטי, מוות של תאים סמנים הניטריט.

Protocol

יום אחד לפני הניסוי:

1. אפשר BME (גורם גדילה מופחת, Cultrex, Trevigen) להפשיר על הקרח או על 4 מעלות צלזיוס; מופשר פעם לשמור על הקרח כדי למנוע מחדש לחיזוק.

יום של הניסוי:

1. עכברים (6-7 שבועות) יש הרדים ודימם.
2. אבי העורקים החזי הסר לתוך צלחת פטרי מלאות קר סטרילי PBS.
3. בצע ניקוי מכני של לרקמות שומן. שים לב, למנוע ייבוש של האאורטה בכל עת.
4. שימוש בלהב כירורגי, פרוסה באופן שווה לתוך אבי העורקים 1 מ"מ טבעות. לחתוך חייב להיות אחיד ונקי.
5. העברת טבעות טרי קר PBS ולשמור על הקרח בכל עת.
6. באמצעות טרום מקורר טיפים פיפטה, להוסיף גם כל צלחת 48-באר טיפה מעוגלות של BME 150 מ"ל קר. אפשר טיפה BME לחזק ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20-30 דקות.
7. מניחים טבעת אבי העורקים יחיד במרכז החלק העליון של הכיפה כל אחד. דגירה במשך 10 דקות על 37 ° C.
8. על גבי כל טבעת להוסיף BME נוסף 150 מ"ל. דגירה של 20-30 דקות על 37 ° C.
9. הכן בינוני: בינוני האדם אנדותל חופשי בסרום (GIBCO, בקרלסבד, קליפורניה) בתוספת FCS 2%, 50 יחידות / מ"ל ​​פניצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (Cellgro).
10. לכל אחד גם להוסיף 500 מ"ל בינוני המכיל גם:
    1. ניסיוני דגימות.
    2. בקרה חיובית: תא האנדותל צמיחה תוספת (ECGS, הריכוז הסופי 200 מיקרוגרם / מ"ל, BD Biosciences).
    3. שליטה שליליות: בינונית בלבד.
11. צלחת לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 12 ימים, טבעות תצלום בין 6 ימים ו -12 תחת stereoscope שלב תקן בניגוד.
12. אופציונלי: איסוף supernatants.

הערות:

1. שמור בתנאים סטריליים בכל עת.
2. הימנע הקדמה של בועות לתוך BME.

Discussion

Assay טבעת אבי העורקים הוא כלי מועיל בדרך להעריך angiogenic כמו גם נגד גורמים angiogenic. כלי שגדלים מתוך תאים טבעות אבי העורקים לגייס שרירים חלקים pericytes לקשר עם צינור תא האנדותל, כלומר שהם דומים מבחינה אנטומית neovessels in vivo. יתר על כן, אבי העורקים עכבר assay הטבעת מחזיקה את היתרון של מערך עצום של כלים מהונדס זמין עבור מין זה. עם זאת, יש כמה חסרונות ל assay את הטבעת אבי העורקים. ראשית, כלי תולדה in vivo מתרחשת מתוך microvessels ולא מכלי מרכזיים כגון אבי העורקים. חוסר העקביות שנית, בטיפול של הטבעות ואת כמות לרקמות שנותרו על הספינה יכולה להשפיע על תוצאה כלי שיט. טבעות מ aortas שונים או בגילאים שונים של עכברים זנים יכול גם להפריע התגובות angiogenic. ולבסוף, תולדה כלי angiogenic מתרחשת בשלושה ממדים, מה שהופך אותו ללא אידיאלי לצלם ולכמת. יחדיו, כאשר היא מבוצעת עם בקרה פנימית מספיק עם חוזר מרובים, assay זו היא פשוטה יחסית, לא יקר, מאוד אינפורמטיבי מעולה משמעותית תרבויות אנדותל המורכבות הביולוגית ואת הרלוונטיות שלה.