Summary
血管新生は、既存の血管からの血管の出芽は、自然および病理学的プロセスの両方に関連付けられています。ここでは、血管新生増強と阻害剤が直接文化の大動脈輪に追加できる大動脈リングアッセイを示す。発芽しneovessel伸長は6-12日の期間にわたって大動脈リングを調べることによって決定することができます。
Abstract
血管新生は、既存の血管から血管の発芽は、自然および病理学的プロセスの両方に関連付けられています。様々な血管新生アッセイは、培養条件（1）の個々の内皮細胞の研究を含む。大動脈リングアッセイは、器官培養に基づいている血管新生モデルです。このアッセイでは、血管新生血管は、大動脈のセグメント（（2）から変更）から成長する。簡単に言えば、マウス胸部大動脈を摘出され、脂肪層と外膜が除去され、リングの長さは1mm程度が用意されています。個々のリングはその後48ウェルプレートの各ウェルの内部にキャスト、地下の行列のエキスの小さな固体ドーム（BME）に埋め込まれています。血管新生因子と血管新生の阻害剤は、直接リングに追加することができます、そして大動脈リングおよび他の細胞型の混合共培養は、パラクリン血管新生効果の研究に用いることができる。発芽は6-12日の期間にわたって実体顕微鏡下で検査により観察される。大動脈セグメントの不規則性によって引き起こされる大規模な変化が原因で、6 plicatesで実験することが強く推奨されます。 Neovesselの伸長は、位相差顕微鏡を用いて実験し、画像化された全体に監視され、そして上清を、関連する血管新生および抗血管新生因子、細胞死のマーカーと亜硝酸の測定のために収集されます。
Protocol
実験前日：
- BMEは（減少成長因子、Cultrex、Trevigen）氷上または4℃で解凍できるよう℃、一度、再固化を防止するために氷上で維持解凍した。
実験日：
- マウスは（6-7週齢）を麻酔されると外出血。
- 冷滅菌PBSで満たしたシャーレに胸部大動脈を削除します。
- 脂肪組織の周囲からの機械的なクリーニングを行います。いつでも、大動脈の乾燥を防ぐため、注意してください。
- スライスの大動脈は、1mmのリングに均等に、外科用ブレードを使用する。カットは、均一できれいにする必要があります。
- 新鮮な冷PBSにリングを移し、すべての回では氷上に置きます。
- 予冷ピペットチップを使用して、48ウェルプレートの各ウェルに150 mlの冷BMEの丸いドロップを追加。 BMEドロップが37で固化することができます° 20〜30分のためのC。
- 各ドームの上部中央にある単一の大動脈リングを置きます。 37℃で10分間インキュベート℃に
- 各リングの上に追加の150mlのBMEを追加。 37℃で20-30分インキュベート℃に
- 培地の準備：ヒト血管内皮無血清培地（GIBCO、カールスバッド、カリフォルニア州）は、2％FCS、50ユニット/ mlペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン（Cellgro）で補足。
- それぞれにうまくいずれかを含む500 mlの培地を追加します。
- 実験サンプル。
- 陽性対照：血管内皮細胞増殖サプリメント（心電図、最終濃度200μg/ mlの、BD Biosciences社）。
- ネガティブコントロール：一人でミディアム。
- 37プレートをインキュベート℃で12日間C、標準的な位相差ステレオスコープの下で日6〜12の間に写真のリングを。
- オプション：上清を収集。
注意事項：
- 常に無菌状態を保つ。
- BMEへの気泡の導入は避けてください。
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Discussion
大動脈リングアッセイは、血管新生だけでなく、抗血管新生因子を評価する方法に関する有益なツールです。彼らは生体内で neovesselsに解剖学的に類似していることを意味し、内皮細胞のチューブに関連付ける大動脈輪募集平滑筋細胞および周皮細胞から成長する船。さらに、マウスの大動脈リングアッセイは、この種で使用可能なトランスジェニックツールの広大な配列の利点を保持しています。まだ、大動脈リングアッセイには、いくつかの短所があります。最初に、in vivoでの血管の伸長は、微小血管からではなく、そのような大動脈などの主要な血管から発生します。第二に、リングの取り扱いと容器上に残っている周囲の組織の量に矛盾が血管の伸長に影響を与えることができます。別の大動脈または別のマウスの年齢及び系統からの指輪でも血管新生反応を妨害することができる。そして最後に、血管新生血管の伸長は、非理想的な撮影と定量化することになる三次元、で発生します。一緒になって、十分な内部コントロールを使用して、複数の繰り返しで実行される場合に、このアッセイは、非常に有益とその生物学的複雑さと関連性の内皮の培養より有意に優れ、非高価、比較的簡単です。
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References
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- Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis. Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).
