Summary
Ангиогенез, прорастание кровеносных сосудов из уже существующих сосудистой сети, связано как с естественными и патологических процессов. Здесь мы показываем, аортального кольца анализа, который позволяет ангиогенных усилителей и ингибиторов быть непосредственно добавлен аортального кольца в культуре. Проросшие и neovessel результат может быть определена путем проверки аортального кольца в течение 6-12 дней.
Abstract
Ангиогенез, прорастание кровеносных сосудов от существующего сосудистой связано как с естественными и патологических процессов. Различные тесты ангиогенеза включать изучение отдельных эндотелиальных клеток в культуре условий (1). Анализ аортального кольца ангиогенеза модель, которая основана на органе культуры. В данном анализе ангиогенных судов растут из сегмента аорты (с изменениями от (2)). Короче говоря, мышь грудной аорты иссекается, жирового слоя и адвентиции удаляются, и кольца примерно на 1 мм в длину готовы. Индивидуальные кольца, то встроенных в мелких твердых купол подвале матрицы экстракт (BME), литые внутри отдельных скважинах 48-луночного планшета. Ангиогенных факторов и ингибиторов ангиогенеза может быть непосредственно добавлен в кольца и смешанных со-культуры аортального кольца и другие типы клеток могут быть использованы для изучения паракринной ангиогенных эффектов. Проращивание наблюдают инспекции в соответствии с стереомикроскопа в течение 6-12 дней. Из-за большого изменения вызваны нарушениями в сегментах аорты, экспериментирование в 6-усложняет настоятельно рекомендуется. Neovessel продукт контролируется в течение всего эксперимента и отображаемого с использованием фазовых микроскопии и супернатанты собирают для измерения соответствующих ангиогенных и анти-ангиогенных факторов, гибель клеток маркеры и нитритов.
Protocol
За день до эксперимента:
- Разрешить BME (уменьшение фактора роста, Cultrex, Trevigen) таять на льду или при температуре 4 ° С; После оттаивания держать на льду, чтобы предотвратить повторное затвердевание.
День эксперимент:
- Мыши (6-7 недель) должны быть под наркозом, и кровь из.
- Удаление грудной аорты в чашку Петри заполнены холодной стерильной PBS.
- Выполните механическую очистку от окружающей жировой ткани. Обратите внимание, во избежание высыхания аорты в любое время.
- Использование хирургического лезвия, ломтик аорты равномерно в 1 кольца мм. Срез должен быть однородным и чистым.
- Передача кольца на свежий холодный PBS и держать на льду во все времена.
- Использование предварительно охлажденный советы пипетки внести в каждую лунку в 48-луночного планшета округлые капли 150 мл холодной BME. Разрешить BME снизится до затвердевают при 37 ° С в течение 20-30 минут.
- Место одного кольца аорты в верхней центральной части каждого купола. Инкубируйте в течение 10 минут при температуре 37 ° C.
- На вершине каждого кольца добавить еще 150 мл BME. Инкубируйте в течение 20-30 минут при температуре 37 ° C.
- Подготовка среды: человеческих эндотелиальных бессывороточной среде (GIBCO, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 2% FCS, 50 ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина (Cellgro).
- Для каждой лунки добавить 500 мл среды, содержащей либо:
- Экспериментальные образцы.
- Положительный контроль: Эндотелиальная дополнения рост клеток (ЭКГ, конечной концентрации 200 мкг / мл, BD Biosciences).
- Отрицательный контроль: Средний одиночку.
- Инкубируйте пластины при температуре 37 ° C в течение 12 дней, фотографии кольца между днями 6 и 12 по стандарту стереоскоп фазового контраста.
- Дополнительно: Сбор супернатанты.
Примечания:
- Держите стерильных условиях в любое время.
- Избегайте введение пузырьков в BME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Аортального кольца анализ является полезным инструментом на пути к оценке ангиогенеза, а также анти-ангиогенных факторов. Судов, которые растут из аортального кольца набирать гладкомышечных клеток и перицитов общаться с эндотелиальной трубки клетка, а это означает, что они похожи на анатомически neovessels в естественных условиях. Кроме того, кольца аорты мыши анализа держит преимущество широкий спектр трансгенных инструментов, доступных для данного вида. Тем не менее, Есть несколько недостатков аорты анализа кольцо. Во-первых, суда нарост в естественных условиях происходит из микрососудов, а не от крупных сосудов, таких как аорты. Во-вторых, несогласованность в работе с кольцами и количества окружающих тканей, остающихся на судне могут влиять на результат судна. Кольца из различных возрастов аорты или другую мышь и штаммы могут также столкнуться с ангиогенных ответов. И, наконец, результат ангиогенных судна происходит в трех измерениях, что делает его неидеальной фотографировать и количественно. Взятые вместе, когда они выполняются с достаточной внутреннего контроля и с множеством повторов, этого анализа является относительно простым, не дорого, очень информативный и значительно превосходил эндотелиальных культур в своей биологической сложности и значимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular Research. 74, 172-183 (2007).
- Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis. Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).
