Summary
토양 미생물 커뮤니티의 높은 분자량과 높은 품질의 게놈 DNA를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다.
Abstract
토양 microbiome이 속속들이 지상파 생태계 내에서 영양과 에너지 흐름과 관련된 게놈 다양성과 신진 대사 혁신의 광대한 상대적으로 미개척 저수지입니다. 또한 metagenomic로 알려진 육성 독립 환경 게놈, 접근 방식은 높은 가치 치료 및 바이오 매스 변환 프로세스에 대한 경로 재건 및 기능 검사와 관련이 유전 정보에 대한 전례없는 접근을 약속드립니다. 그러나, 토양 microbiome은 여전히 큰 삽입 라이브러리 생산을위한 충분한 품질의 높은 분자량의 DNA를 얻는의 어려움으로 인해 크게 도전 남아있다. 여기 우리는 토양과 퇴적물에서 높은 분자량, 미생물 지역 사회 게놈 DNA를 추출하기위한 프로토콜을 소개합니다. 절연 게놈의 DNA의 품질은 하류 시퀀싱 및 심사 애플 리케이션을위한 대형 삽입 환경 게놈 라이브러리를 구축에 이상적입니다.
절차는 세포 용해와 함께 시작합니다. 세포 벽 및 미생물의 세포막은 두 기계 (연삭)와 화학 세력 (β - 메르 캅 토 에탄올)에 의해 lysed 있습니다. 게놈 DNA는 다음 추출 버퍼, 클로로포름 - isoamyl 알콜과 이소 프로필 알코올을 사용하여 격리됩니다. 용해와 추출 단계에 대한 고용 버퍼는 구아니딘의 isothiocyanate 및 높은 분자량의 게놈의 DNA의 무결성을 유지 hexadecyltrimethylammonium의 브로마이드 (CTAB)를 포함합니다. 귀하의 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 분리된 게놈의 DNA가 더 세슘 염화물 (CsCl) humic 지방산을 포함하여 불순물을 감소 기울기 ultracentrifugation을 사용하여 정화 수 있습니다. 첫 번째 절차, 추출, DNA의 양을 정함 단계 제외한 약 8 시간 정도 소요됩니다. CsCl ultracentrifugation 기울기는 이틀 과정입니다. 전체 절차를 수행하는 동안, 게놈 DNA는 전단을 방지하기 위해 부드럽게 다루어야하는, 심각한 vortexing을 방지하고, 거칠 반복적인 pipetting.
Protocol
부품 I : DNA의 추출
절차
1. 8시간는 DNA의 양을 정함을 제외한 6 샘플 처리를 위해, 필요합니다.
당신이 추출을 시작하기 전에, 당신은 사전 진정 박격포, 유봉 및 -20 ° C의 냉동고에 주걱이나 액체 질소를 사용해야합니다. 또한, 얼음 20 ML 클로로포름 isoamyl 알콜 (24:1)를 포함하는 사전 진정 50 ML 튜브. 65 하이브 리다이 제이션 오븐을 설정 ° C 미리 열 수 있습니다. 그것 ° C 크리스탈을 녹일 60 따뜻한 크리스털 경우, CTAB 솔루션을 확인하십시오. 당신이 추출 (아래 제조법 참조)을 시작하기 직전 마지막으로 재료를 추가하여 denaturing 솔루션 및 추출 버퍼를 완료하십시오. 펌 후드의 모든 추출 절차를 실시합니다.
2. denaturing 버퍼와 추출 버퍼를 준비합니다.
참고 : DNA의 수율을 최대화하기 위해서는 정확하게 지침에 따라 버퍼를 만들기 위해 중요합니다.
3. 미리 차게 절구에 흙 2g를 놓습니다.
참고 : 현장에서 수집된 토양은 전송을 위해 드라이 아이스를 동결하고 -80 ° C.에 보관해야 해동 사전 DNA 추출에 2mm의 체 체를 사용하여 토양. 당신이 10 G.까지 토양의 시작 양을 증가시킬 수
4. 흙에 솔루션을 denaturing 1 ML을 추가합니다.
5. 고정과 토양 입자 가루와 동질적인 모양까지 유봉을 사용하여 두 액체 N에있는 흙을 분쇄. 동결 두 번 연삭를 반복합니다.
참고 : 동안 냉동 토양 샘플을 보관, 연삭 완전히 토양 샘플을 커버하기에 충분한 액체 질소를 사용합니다. 연삭 중에 약간 녹아이 허용됩니다.
6. 미리 차게 주걱을 사용하여 50 ML 원뿔 관에 지상 토양을 전송합니다.
참고 : 지상 토양 샘플은 -80 ° C이 시점에서, 필요한 경우에 저장될 수 있습니다.
7. 추출 버퍼 9 ML을 추가합니다. 솔루션 및 토양, 낮은 속도로 소용돌이를 간략하게 혼합합니다.
참고 : 버퍼가 균질되도록하려면 60을 따뜻한 ° C를 사용하기 전에 10~15분하십시오. 추출을 통해 60 ° C에서 버퍼의 나머지 부분을 유지. 속도 8 소용돌이 (10이 최대입니다 규모).
8. 하이브 리다이 제이션 오븐에 65 ° C 40 분 품어. 부화 기간 동안 지속적으로 가장 낮은 속도로 튜브를 회전하거나, 부드럽게 튜브를 매일 10 분 반전.
참고 : 버퍼가 큰 표면적을 통해 흙을 문의할 수 있도록 하이브 리다이 제이션 오븐에 수평으로 튜브를 삽입합니다. 이 솔루션은 부화하는 동안 약간의 점성을 보일 수 있습니다.
9. 14 ° C. - 10 10 분 1,800 X g에서 원심 분리기 20 ML 클로로포름 - isoamyl 알콜 (24:1)이있는 미리 차게 50 ML 원뿔 관에 뜨는 전송, 얼음 계속.
참고 : 뜨는 전송할 때, 유기 층 (바닥 층)을 방해하지 않도록주의합니다. 그것은 깨끗한 표면에 뜨는를 수집하기 위해 필요한 경우 뜨는 1-2 ML 둡니다. 당신은 자주 뜨는 위에 베이지색 레이어를 (두께 약 1-3밀리미터)을 볼 수 있습니다. 뜨는를 수집 때이 레이어를 방해하지 마십시오. 이 베이지색 레이어의 파손을 방지하기 위해 튜브 벽을 따라 팁을 슬라이드보십시오. 뜨는 너무 흐린 경우 뜨는에서 클로로포름 - isoamyl 알콜 추출 한 더 많은 시간을 반복하십시오. 클로로포름를 전송할 때 클로로포름가 플라스틱을 녹일하므로, 일회용 플라스틱 pipettes를 사용하지 마십시오. 유리 피펫을 사용하여, 또는 유리 실린더 졸업 또는 50 ML 원뿔 튜브에 직접 클로로포름을 따라줘.
10. 토양 알약에게 두 번 이상의 압축을 풉니다;
10.1. 토양 알약 5 ML 추출 버퍼를 추가 부드럽게 낮은 속도로 짧은 vortexing 다음 1 ML 팁을 사용하여 섞는다.
참고 : 흔들 어서 사용하기 전에 버퍼를 섞는다.
10.2. 65 ° C 하이브 리다이 제이션 오븐에서 10 분 알을 품다. 14 ° C. - 10 10 분 1,800 X g에서 원심 분리기
9 단계에서 튜브에 뜨는 전송합니다. 튜브 수집 뜨는 및 클로로포름 - isoamyl 알콜로 추출하는 동안 얼음 계속.
참고 : 교차는 샘플 사이에 혼합하지 않고 같은 튜브에 뜨는를 추가하십시오.
10.3. 9.1 및 9.2 한 번 더 반복합니다.
11. 회전 접시를 사용하여 매우 부드럽게 수집 뜨는 (14-19 ML) 10 분 1.25 RPM에서 클로로포름 - isoamyl 알콜이 들어있는 튜브를 바위.
참고 : 누출을 방지하기 위해 매우 단단히 뚜껑을 닫습니다. 어떤 누출이 쉽게 감지 수 있도록 당신이 튜브를 삽입하기 전에 흔들어 대 접시에 종이 타월을 놓는다.
12. 14 ° C. - 10 20 분 1,800 X g에서 원심 분리기
13. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송합니다.
참고 사항 : 수성 단계 (위 계층)과 유기 계층 (하단 사이의 계면을 방해하지 마십시오층)은 표면에 뜨는를 전송할 때. 오직 깨끗한 뜨는 수집을 보장하기 위해 약 1.5-2 ML이 뜨는 둡니다.
14. 이소 프로필 알코올 (- 21.a 15.a 단계)를 사용하여 DNA를 복구합니다. 또는 Amicon를 사용하여 ® 울트라 - 15 원심 필터 장치 (단계 15.b - 21.b)는 복구하기가 어렵습니다 이소 프로필 알코올 석출에 의해 거의 볼 수 펠렛을 생산합니다 샘플에서 바이오 매스의 매우 낮은 금액을 기대하는 경우.
15.a. 새로운 관 초원 심 분리기에 뜨는를 놓습니다.
16.a. 0.6:1의 음량 비율에서 수집한 뜨는에 이소 프로필 알코올을 추가합니다. 튜브 반전 부드럽게 몇 번 혼합합니다.
실온에서 30 분 17.a의 알을 품다.
18.a. 25 ° C. - 20 20 분 16,000 X g에서 원심 분리기 모든 튜브의 가중치는 원심 분리 단계 전에 잘 균형을 수 있도록.
참고 : 튜브에 원심력의 방향을 표시하므로 DNA 수율이 낮은 때보다 쉽게 DNA 펠렛를 검색할 수 있습니다.
19.a. decanting 또는 진공 suctioning에 의해 이소 프로필 알코올을 제거합니다. DNA 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오.
참고 사항 : 즉시 원심 분리가 완료되면 이소 프로필 알코올을 제거합니다. DNA 펠렛을 잃지 않도록 매우주의하십시오. DNA 펠렛의 크기는 거의 공개 (~ 9mm 지름) 명확하게 표시에서, 토양 유형에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 그것은 DNA 펠릿 밖으로 흡입에주의 때문에 튜브의 벽을 따라하는 것도 suctioning에 의해 이소 프로필 알코올의 찌꺼기를 제거하는 것이 좋습니다.
20.a. 5 상온에서 건조 DNA 펠릿 - 20 분.
참고 : 건조 DNA 펠렛 이상하지 마십시오, 그렇지 않으면 그것은 DNA를 redissolve하기 어려울 것입니다.
21.a. 200 μl TE에서 DNA 펠렛을 Resuspend. 부드러운 감청하여 섞는다. 1.5 ML 튜브에 DNA 솔루션을 전송합니다. 4 튜브를 유지 ° C 완벽한 DNA를 해산하기 위해 하룻밤.
참고 : 펠렛의 크기에 따라 추가 TE의 볼륨을 조정할 수 있습니다. 보통 200 - TE 400 μl 잘 작동합니다.
* 또는 단계를 수행하십시오 15.b - 21.b.
15.b. Amicon ® 울트라 - 15 원심 필터 장치를 미리 씻고, 10 분 동안 3,500 X g에서 장치와 원심 분리기 15 ML TE를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
16.b. 단계 13에서 미리 씻어 Amicon 필터로 DNA 솔루션을 놓습니다. DNA의 볼륨이 200 감소까지 3,500 X g에서 원심 분리기 - 500 μl합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
17.b. 두 TE와 DNA를 세척하고, Amicon 필터 장치 10 ML TE를 추가합니다. DNA의 볼륨이 약 200 μl로 감소까지 3,500 X g에서 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. 한 번만 더 반복합니다.
18.b. 새로운 1.5 ML 튜브에 필터의 DNA 솔루션을 전송합니다.
19.b. Amicon 필터 40 μl TE를 추가합니다. 필터에있는 DNA 성분을 회수하기 위해 최대 pipetting 아래로 필터 세포막의 두 측면을 씻으십시오. 단계 18.b.에서 관이 세척 솔루션 추가
20.b. 필요한 경우, DNA가 Microcon ® Ultracel YM - 30 원심 필터 단위로 더욱 집중 할 수 있으며, 7분에 대한 10,000 X g에서 200 μl TE 및 centrifuging을 추가하여 필터를 미리 씻는다. 1 분 5000 X g에서 필터와 원심 분리기에 DNA 솔루션을 추가합니다. 필터에 DNA 솔루션의 금액은 약 50 μl로 감소 때까지 원심 분리를 반복합니다.
참고 : Microcon 필터에 대한 최대 초기 샘플 볼륨 500 μl입니다. 14,000 X G. 이상의 속도로 원심 분리기하지 마십시오 완전히 막 증발까지 원심 분리기를 통해하지 마십시오. 어떤 액체가 계속 원심 분리 후 필터를 다루고 있는지 확인하십시오. 당신은 이상 centrifuged 및 멤브레인가 건조되면 15 μl TE를 추가 30 초 동안 부드럽게 선동하고, 21.b. 단계로 진행
21.b. DNA를 복구 3 분 XG 1000에서 새 Microcon 튜브와 원심 분리기에 거꾸로 필터 장치를 놓습니다.
22. 태 젤로 DNA (0.8 %, 0.5xTAE 4 시간 50 V)를 계량하고, Nanodrop 분광 광도계 또는 피코 - 녹색 분석 및 플레이트 판독기에 의해.
참고 : DNA 금액이 젤에 알려진 농도 (고분자 DNA 마커 또는 λHindIII)와 마커 밴드에 대한 샘플 밴드를 비교하여 추정 수 있습니다.
23. (자세한 내용은 단계 II를 참조하십시오에서 파트 1 %, 1xTAE 젤과 함께 펄스 필드 겔 전기 영동 (PFGE)를 사용하여 높은 분자량의 DNA의 무결성 확인 http://www.jove.com/index/details.stp?id을 = 1387 , 도이 : Taupp 외 의해 10.3791/1387 2009)..
참고 : 대신 낮은 용해 아가로 오스의 QC 목적을 위해 정기적으로 아가로 오스 젤을 사용할 수 있습니다. 다음과 같이 간단히, 전기 영동 조건은 다음과 같습니다 2-250킬로바이트, 6 볼트, 초기 전환 시간 : 5 초, 최종 전환 시간 : 15 초, 14에서 12 시간 동안 실행 ° C. SYBR 골드가 젤에서 DNA를 시각화 한 시간 염색법.
24. 추출된 DNA의 분자 가중치를 만족하는 경우, 다음 CsCl 기울기 원심 분리기 단계로 진행합니다. 또는 DNA는 -20 ° C 또는 -80에 저장할 수 있습니다 ° C CsCl 원심 전에.
당신은 큰 삽입 metagenomic의 DNA 라이브러리를 구축하려는 경우 DNA의 평균 크기는 동일 또는 36 KB을 초과해야합니다.
부 II. 세슘 염화물 기울기 ultracentrifugation을 사용하여 DNA의 정화
원심 분리기의 준비 : 1.5 - 이시간
원심 분리 단계 : 18시간
ethidium 브로마이드 (EtBr)를 제거하고 원심 분리 후 DNA 집중 : 3 시간
절차
자세한 내용은 라이트 외를 참조하십시오. . 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , 도이 : 10.3791/1352
대표 결과 / 결과
이 숲 토양 유기의 g (O 수평선)과 미네랄 호라이즌 (AE, AB, 그리고 BT 호라이즌) (장기 토양 생산성 (LTSP) Skulow 호수, BC, 캐나다에있는 사이트에서 샘플에서 격리 게놈 DNA의 총액 과) 숲 범위 BC 교육부에서 관리하는 10 밀리그램에서 180 밀리그램였다. 60킬로바이트 (그림 1) - 절연 DNA의 평균 크기는 40 사이에 일반적으로되었다. 260 nm/280 NM에서 흡광도의 비율은 1.3-1.6 사이 종종 토양 샘플에서 관찰 humic 산성 오염을 나타낼 수 있습니다 230 NM에서 최고가있었습니다. CsCl 기울기 원심 분리가 대폭이 오염을 감소하며 1.8 280분의 260의 비율을 증가 - 1.9을 그림 2A와 2B와 같이.
CsCl ultracentrifugation 전에 추출한 게놈의 DNA의 그림 1. PFGE 사진. lane1 : 1킬로바이트 마커 100 NG, 레인 2 : λHind III 마커 100 NG, 레인 3 : λHind III 마커 250 NG, 레인 4 : λHind III 마커 500 NG, lane5 : Fosmid 36킬로바이트 마커 100 NG, 레인 6과 7 : 게놈 미네랄 토양 수평선 애, 레인 8 9 절연 DNA : Skulow 호수, BC에 위치한 LTSP 사이트의 광물 토양 호라이즌 AB으로부터 격리 게놈 DNA
게놈 DNA의 그림 2. Chromograms 전에 분광 광도계에 의해 감지 (A) 및 CsCl ultracentrifugation의 (B) 후. 게놈 DNA의 품질 향상을 나타냅니다 CsCl의 ultracentrifugation, 후 230 nm의 파장에서 흡광도 값의 감소에 유의하십시오. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 산림 토양의 생산성의 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금, 게놈 브리티시 컬럼비아과 숲의 브리티시 컬럼비아 교육부와 범위에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. SL은 미생물 다양성과 발전을위한 기초 자금 툴라 센터에서 화목에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| *Denaturing solution: 10 ml in total | |||
| Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g | |||
| 1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl | |||
| 0.5M EDTA, 20 μl | |||
| Add water to 9.95 ml in total. | |||
| Autoclave. | |||
| Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution) | |||
| Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use. | |||
| **Extraction Buffer | |||
| 1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml | |||
| 1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml | |||
| 0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml | |||
| 5 M NaCl, 300 ml | |||
| Autoclave and keep it at room temperature. | |||
| Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. | |||
| * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 | |||
| Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended. | |||
References
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
