Summary
一个隔离土壤微生物群落的超高分子量和高品质的基因组DNA的方法来描述。
Abstract
土壤中微生物的基因组多样性和代谢创新是密切相关的陆地生态系统内的养分和能量流的庞大和相对未开发的的油藏。培养独立的环境基因组，也被称为宏基因组学，方针的前景前所未有的访问，这种遗传信息通路的重建和对高价值的治疗和生物转化过程中的功能筛选。然而，土壤中的微生物仍然是一个挑战，主要是由于在获得大量插入库生产质量足够高的分子量DNA的难度。在这里，我们介绍了从土壤和沉积物中提取的分子量高，微生物群落的基因组DNA的协议。分离出基因组DNA的质量是建设下游的测序和筛选应用环境大插入基因库的理想。
程序启动细胞裂解。微生物的细胞壁和膜机械（磨）和化学力（β-巯基乙醇）溶解。分离基因组DNA提取缓冲液，氯仿 - 异戊醇，异丙醇。受雇于裂解和提取步骤的缓冲区，包括异硫氰酸胍和十六烷基铵（CTAB），以保持超高分子量基因组DNA的完整性。根据您的下游应用，可进一步纯化分离出的基因组DNA，使用氯化铯（CSCL）梯度离心，从而减少杂质，包括腐殖酸。第一个程序，提取，大约需要8小时，不包括DNA定量的一步。 CsCl梯度超速离心法，是为期两天的过程。基因组DNA在整个过程中，应被视为轻轻地防止剪切，避免剧烈震荡，反复苛刻的吹打。
Protocol
第一部分：DNA的提取
程序
1。 8小时是必需的，用于处理6个样品，不包括DNA定量。
在您开始之前提取，你将需要预先寒意砂浆，杵和抹刀在-20 ° C冰箱或使用液态氮。此外，前寒意50毫升20毫升氯仿异戊醇（24:1）包含在冰上管。设置杂交炉至65 ° C预热。检查CTAB溶液，如果它是结晶温暖至60 ° C至融化的晶体。完成加入，最后的成分，只是在开始之前提取（见下文配方）的变性液和提取液。在通风橱中进行所有提取程序。
2。准备变性缓冲液和提取液。
注：为了最大限度的DNA产量，关键是精确地按照指示的缓冲区。
3。将在预冷迫击炮2克的土壤。
注意：应在现场收集的土壤干冰冷冻运输和储存在-80 ° C解冻和使用DNA提取前2毫米筛筛土。您可以增加土壤的起点金额高达10克
4。添加1毫升变性液对土壤的。
5。冻结和研磨液ñ的土壤 2使用杵，直到土壤颗粒看上去粉状和同质。重复冻结和磨两次。
注：冻结期间保持土壤样品的研磨，用足够的液氮，全面覆盖的土壤样品。在研磨过程中的轻微融化是可以接受的。
6。泥土转移至50 ml锥形管，使用前冷冻锅铲。
注：可以储存在-80 ° C在这一点上，如有必要，地面土壤样品。
7。加入9毫升提取液。要混合的解决方案和土壤，在低速旋涡简要。
注：为了确保缓冲区是均匀的，温暖的，在60 °为10-15分钟，使用前彗星。整个提取其余的缓冲区保持在60 ° C。旋涡速度8（其中10是最大规模）。
8。孵育40分钟，在65℃杂交炉。在孵化过程中，不断旋转管的最低速度，或轻轻反转管每10分钟。
注：水平放置在杂交炉管，让缓冲区接触比表面积大的土壤。该解决方案孵化过程中可能看起来有点粘稠。
9。离心1800 × 克 ，10分钟在10 - 14 ° C上清转移到预冷含20毫升氯仿异戊醇（24:1）50 ml锥形管，置于冰上。
注意：当你转移上清，要小心，不要扰乱有机层（底层）。如果它是必要的，以便只收集干净上清，留下1-2毫升上清。你经常可以看到一个米色上清顶部层（约1-3毫米的厚度）。收集上清液时，请勿打扰这一层。尝试幻灯片沿管壁的提示，以防止本米色层破损。如果上清太浑浊，重复的氯仿 - 异戊醇提取上清液一次。不要使用一次性塑料吸液管转移氯仿，氯仿将熔化的塑料。使用的玻璃吸管，或玻璃量筒，或直接倒入50 ml锥形管氯仿。
10。土壤颗粒提取2次以上;
10.1。加入5 ml提取缓冲液中的土壤颗粒，轻轻地混合使用1毫升的小费在低速短暂的震荡。
注意：摇晃和混合使用前的缓冲区。
10.2。孵育在65℃杂交炉中10分钟。离心1800 × 克，10分钟在10 - 14 ° C
转移上清管在第9步。保持管冰在提取过程中收集上清和氯仿 - 异戊醇。
注意：请确保您添加混合样本之间无交叉上清同一管。
10.3％。重复9.1和9.2有更多的时间。
11。使用一个旋转盘，很轻轻摇动试管，其中包含所收集的上清（14-19毫升）和氯仿 - 异戊醇1.25 10分钟的转速。
注：盖上盖子，非常严密，防止泄漏。奠定了纸巾上的摇板，然后放置在管，所以可以很容易地检测到任何泄漏。
12。离心机在1800 × G，在10分钟20 - 14 ° C。
13。水相转移到一个新的管。
注：请勿打扰之间的水相（顶层）和有机层（底部相间层），当您将上清转移。离开约1.5 - 2毫升上清，以确保只有清洁上清的收集。
14。恢复使用异丙醇（步骤15.a - 21.a）的DNA。另外，使用Amicon ®超15离心过滤装置（步骤15.b - 21.b）如果你希望生物质在你的样品量非常低，这将产生异丙醇沉淀，难以收回几乎没有可见的颗粒。
15.a.将上清液到一个新的管超速离心机。
16.a.添加异丙醇在体积比为0.6:1的收集上清。反转管轻轻几次混合。
17.a在室温下30分钟的孵育。
18.a.离心16000 X克，20分钟20 - 25 ° C。确保所有管的重量是平衡的离心步骤之前。
注：马克管离心力的方向，所以你可以检测出DNA沉淀时更容易DNA产量低。
19.a.取出调迁或真空抽吸异丙醇。小心不要打扰DNA沉淀。
注：尽快删除异丙醇，离心完成。要非常小心，不要失去DNA沉淀。 DNA沉淀的大小可以有很大的不同取决于土壤类型，从清晰可见（〜9毫米直径），难以看清。这是建议由吸痰沿管壁小心，以免吸出的DNA沉淀，去除残留的异丙醇。
20.a.在室温下干燥DNA沉淀5 - 20分钟。
注意：不要超过干燥DNA沉淀，否则将难以溶解的DNA。
21.a.在200μLTE重悬DNA沉淀。温柔攻混合。 DNA溶液转移到1.5 ml管。管保持在4 ° C过夜，以充分溶解DNA。
注：根据颗粒大小，可以调整的TE量添加。一般200 - 400μLTE的效果很好。
*或者按照下列步骤15.b - 21.b.
15.b.预洗Amicon ®超15离心过滤装置，设备和离心机3500 X克中添加15毫升TE为10分钟。丢弃的流量通过。
16.b.将DNA溶液从第13步，预洗Amicon过滤。离心机在3500 X克，直到DNA的体积缩小至200 - 500μL 。丢弃的流量通过。
17.b.两次DNA用TE洗净;添加10毫升TE Amicon过滤装置。在3500 X克离心机，直到DNA量减少约200μL。丢弃的流量通过。重复一次。
18.b. DNA溶液过滤器传输到一个新的1.5 ml管。
19.b.添加40μLTE Amicon过滤。移液器向上和向下，为了恢复在过滤器上的任何DNA残留清洗滤膜两侧。这种洗涤液管一步18.b.
20.b.如果有必要，DNA可进一步由单片机® Ultracel YM - 30离心式过滤器单元的集中;预洗7分钟10000 ×克加入200μLTE和离心过滤器。将DNA溶液，过滤器，并在5000 X克离心1分钟。直到DNA溶液的过滤器上的金额减少约50μL，重复离心。
注：单片机过滤器的最大初始样本量为500μL。不要离心速度超过14000小工直到完全膜干燥不超过离心机。确保一些液体仍然涵盖的过滤器，离心后。如果在离心膜干燥，然后加入15μLTE，搅拌30秒轻轻，并继续加强21.b.
21.b.将过滤装置，倒挂在一个新的单片机管，并在1000 3分钟恢复的DNA XG离心机。
22。量化TAE凝胶DNA（0.5xTAE，0.8％，为4小时50 V），并通过Nanodrop分光光度计或碧绿色的检测和酶标仪。
注：估计DNA的量可以通过比较与已知浓度对凝胶（高分子DNA标记或λHindIII）的样品带，标记带。
23。检查的超高分子量1％，1xTAE凝胶使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）（更多细节见步骤二，在第2部分DNA的完整性 http://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 ，DOI：10.3791/1387 2009年Taupp等） 。
注意：您可以使用这代替的低熔点琼脂糖QC目的普通琼脂糖凝胶。总之，电泳条件如下：2-250 KB，6伏初始开关时间：5秒，最后的开关时间：15秒，12小时运行在14 ° C。 SYBR黄金染色一小时，可视化的DNA凝胶。
24。如果提取的DNA分子量是令人满意的，然后进行以下CsCl梯度离心步骤。另外，DNA可以储存在-20 ° C或-80 ° C之前，氯化铯离心。
的DNA中位数的大小应等于或超过36 KB，如果你想建造一个大型的插入宏基因组DNA文库。
第二部分。 DNA纯化用氯化铯梯度离心
离心制备：1.5 - 2小时
离心步骤：18小时
卸下溴化乙锭（ETBR）和集中DNA离心后：3小时
程序
有关详细信息，请参阅 Wright等。 2009年http://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 ，DOI：10.3791/1352
代表性的成果/成果
从2克（海外地平线）林土壤有机和矿物的视野（AE，AB和转Bt基因视野）（从长期土壤生产力（LTSP）位于加拿大不列颠哥伦比亚省Skulow湖，现场采样分离出基因组DNA的总量由卑诗省森林部和范围管理）从10毫克至180毫克不等。孤立的DNA中位数的大小通常在40 - 60 KB（图1）之间。在260 nm/280 nm的吸光度比例1.3-1.6之间，峰值在230 nm有一个，这可能表明腐殖酸污染往往观察到的土壤样品。 CsCl梯度离心大大减少这种污染，也增加了260/280的比例为1.8 - 1.9图2A和2B所示。
图1。PFGE图片前铯超速离心法提取基因组DNA。 lane1：1 KB标志100纳克，泳道2：λHind三标记100纳克，泳道3：λHind三标记250纳克，泳道4：λHindIII标志500毫微克，lane5：Fosmid 36 KB标记100吴巷6和7：基因组从矿物土层AE巷8和9中分离DNA：从矿物土层的AB孤立的基因组DNA在位于公元前Skulow湖，LTSP网站
图2。Chromograms基因组DNA的检测分光光度计前（A）和氯化铯超速离心（二）后。请注意在铯超速离心法，这表明在基因组DNA质量的改善后在230 nm波长的吸光度值减少。请点击这里看大图图2。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
我们要感谢为加拿大创新，基因组不列颠哥伦比亚省，不列颠哥伦比亚省知识发展基金和不列颠哥伦比亚省森林部和范围基金会，用于支持正在进行的研究森林的土壤生产力。 SL是由微生物多样性和进化图拉基金会资助中心的奖学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| *Denaturing solution: 10 ml in total | |||
| Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g | |||
| 1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl | |||
| 0.5M EDTA, 20 μl | |||
| Add water to 9.95 ml in total. | |||
| Autoclave. | |||
| Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution) | |||
| Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use. | |||
| **Extraction Buffer | |||
| 1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml | |||
| 1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml | |||
| 0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml | |||
| 5 M NaCl, 300 ml | |||
| Autoclave and keep it at room temperature. | |||
| Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. | |||
| * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 | |||
| Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended. | |||
References
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
