Summary
Una metodologia per isolare ad alto peso molecolare del DNA genomico e di alta qualità da parte della comunità microbica del suolo è descritta.
Abstract
Il microbioma suolo è un vasto serbatoio e relativamente inesplorato della diversità genomica e innovazione metabolici che è intimamente associato a sostanze nutritive e flusso di energia negli ecosistemi terrestri. Coltivazione indipendente genomica ambientale, noto anche come metagenomica, approcci promessa accesso senza precedenti a queste informazioni genetiche rispetto alla ricostruzione percorso di screening e funzionale a fini terapeutici ad alto valore e processi di conversione della biomassa. Tuttavia, il microbioma suolo rimane ancora una sfida in gran parte dovuta alla difficoltà di ottenere DNA di alta peso molecolare di qualità sufficiente per la produzione di grandi biblioteche inserire. Qui introduciamo un protocollo per l'estrazione ad alto peso molecolare, DNA genomico comunità microbica da terreni e sedimenti. La qualità del DNA genomico isolato è ideale per la costruzione di grandi librerie di inserimento ambientale genomiche per applicazioni a valle di sequenziamento e di screening.
La procedura inizia con la lisi cellulare. Pareti delle cellule e le membrane dei microbi vengono lisati da entrambe le forze meccaniche (rettifica) e chimici (β-mercaptoetanolo). Il DNA genomico viene poi isolato tramite tampone di estrazione, cloroformio-alcool isoamilico e alcool isopropilico. I tamponi utilizzati per la lisi e fasi di estrazione comprendono isotiocianato di guanidina e esadeciltrimetilammonio bromuro (CTAB) per preservare l'integrità del DNA genomico ad alto peso molecolare del peso. A seconda dell'applicazione a valle, il DNA genomico isolato può essere ulteriormente purificato con cloruro di cesio (CsCl) ultracentrifugazione gradiente, che riduce le impurità tra cui gli acidi umici. Il primo procedimento, l'estrazione, dura circa 8 ore, escluse le passo la quantificazione del DNA. L'ultracentrifugazione gradiente di CsCl, è un processo di due giorni. Durante l'intera procedura, il DNA genomico deve essere trattata con delicatezza per evitare di taglio, evitare vortex severo, duro e ripetitivo pipettaggio.
Protocol
Parte I: Estrazione del DNA
Procedura
1. 8 ore sono tenuti, per l'elaborazione di 6 campioni esclusi quantificazione del DNA.
Prima di iniziare l'estrazione, sarà necessario pre-chill mortaio, pestello e spatola in un congelatore di -20 ° C o con azoto liquido. Inoltre, pre-chill 50 ml provette contenenti 20 ml di cloroformio alcool isoamilico (24:1) su ghiaccio. Impostare il forno di ibridazione a 65 ° C per preriscaldare. Controllare soluzione CTAB, se è cristallizzato calda a 60 ° C per sciogliere i cristalli. Completa la soluzione tampone di estrazione denaturazione e aggiungendo gli ingredienti ultima poco prima di avviare l'estrazione (vedi la ricetta sotto). Condurre tutte le procedure di estrazione in una cappa aspirante.
2. Preparare il tampone di denaturazione e tampone di estrazione.
Nota: Per massimizzare la resa del DNA, è fondamentale per fare proprio buffer seguendo le istruzioni.
3. Mettere 2 g di suolo in un pre-raffreddata malta.
Note: Terreno raccolti sul campo devono essere congelati in ghiaccio secco per il trasporto e conservati a -80 ° C. Scongelare e suolo setaccio usando un setaccio 2 millimetri prima dell'estrazione del DNA. È possibile aumentare l'importo iniziale di terreno fino a 10 g.
4. Aggiungere 1 ml di soluzione di denaturazione al suolo.
5. Congelare e macinare il terreno in N 2 liquido utilizzando un pestello fino a quando le particelle del terreno aspetto polveroso e omogenea. Ripetere il congelamento e macinazione due volte.
Nota: Conservare il campione di terreno ghiacciato durante la rettifica, utilizzando l'azoto liquido a sufficienza per coprire completamente il campione di suolo. Fusione leggero durante la macinazione è accettabile.
6. Trasferire il terreno terreno per un tubo da 50 ml coniche con un pre-raffreddata spatola.
Nota: Il campione di suolo di terra possono essere conservati a -80 ° C a questo punto, se necessario.
7. Aggiungere 9 ml di tampone di estrazione. Per miscelare la soluzione e nel suolo, mescolare brevemente nel vortex a bassa velocità.
Nota: Per garantire il buffer è omogenea, è calda a 60 ° C per 10-15 minuti prima dell'uso. Tenere il resto del tampone a 60 ° C durante tutto l'estrazione. Vortex a velocità 8 (in una scala dove 10 è il massimo).
8. Incubare per 40 minuti a 65 ° C in un fornetto. Durante l'incubazione, continuamente ruotare i tubi alla minima velocità, o capovolgere delicatamente i tubi ogni 10 min.
Nota: posizionare il tubo orizzontalmente in un fornetto per consentire tampone a contatto del terreno su una superficie di grandi dimensioni. La soluzione può sembrare un po 'viscoso durante l'incubazione.
9. Centrifugare a 1800 x g per 10 minuti a 10 - 14 ° C. Trasferire il surnatante in pre-raffreddata tubo 50 ml contenente 20 ml di cloroformio-alcool isoamilico (24:1), tenere su ghiaccio.
Nota: Quando si trasferisce sopranatante, fare attenzione a non disturbare lo strato organico (strato inferiore). Lascia 1-2 ml di supernatante se è necessario al fine di raccogliere solo surnatante pulito. Spesso si può vedere uno strato beige (circa 1-3 millimetri di spessore) sulla parte superiore del surnatante. Non disturbare questo strato al momento del ritiro il sopranatante. Provate a scorrere la punta lungo la parete del tubo per prevenire la rottura di questo strato beige. Se il surnatante è troppo torbida, ripetere l'estrazione di cloroformio-alcool isoamilico ancora una volta sul supernatante. Non usare pipette di plastica monouso durante il trasferimento di cloroformio, il cloroformio si scioglierà la plastica. Utilizzare una pipetta di vetro, o un cilindro di vetro graduato, cloroformio o versare direttamente in provette da 50 ml.
10. Estrarre le palline terreno altri 2 volte;
10.1. Aggiungere 5 ml di tampone di estrazione del pellet suolo, mescolare delicatamente usando 1 ml di punta seguita da brevi vortex a bassa velocità.
Nota: Agitare e mescolare il buffer prima dell'uso.
10.2. Incubare a 65 ° C per 10 minuti in forno di ibridazione. Centrifugare a 1800 x g per 10 minuti a 10 - 14 ° C.
Trasferire il surnatante al tubo al punto 9. Tenere il tubo con raccolte surnatante e cloroformio-alcool isoamilico sul ghiaccio durante l'estrazione.
Nota: assicurarsi di aggiungere il surnatante al tubo stesso senza croce di miscelazione tra i campioni.
10.3. Ripetere 9.1 e 9.2 ancora una volta.
11. Utilizzando una piastra rotante, molto delicatamente roccia il tubo che contiene la raccolta surnatante (14-19 ml) e cloroformio-alcool isoamilico a 1,25 rpm per 10 min.
Nota: Chiudere il coperchio molto strettamente per evitare perdite. Stendere un tovagliolo di carta sul piatto oscillante prima di posizionare il tubo in modo eventuali perdite possono essere facilmente individuati.
12. Centrifugare a 1800 x g per 20 minuti a 10 - 14 ° C.
13. Trasferimento fase acquosa in una nuova provetta.
Nota: Non disturbare l'interfase tra la fase acquosa (strato superiore) e lo strato organico (in bassolayer) quando si trasferisce il surnatante. Lasciare circa 1,5-2 ml surnatante per assicurare la raccolta di soli surnatante pulito.
14. Recuperare il DNA con alcool isopropilico (passo 15.a - 21.a). In alternativa, utilizzare Amicon ® Ultra-15 Dispositivi centrifuga Filter (step 15b - 21.b) se ci si aspetta molto bassa quantità di biomassa nel campione, che produrrà appena visibile a pellet per precipitazione alcool isopropilico che è difficile da recuperare.
15.a. Mettere il supernatante in una ultracentrifuga tubo nuovo.
16.a. Aggiungi alcol isopropilico per il supernatante viene raccolto in un rapporto volume di 0.6:1. Invertire i tubi delicatamente un paio di volte per mescolare.
17.a Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
18.a. Centrifugare a 16000 x g per 20 minuti a 20 - 25 ° C. Assicurare il peso di tutti i tubi sono bilanciati ben prima della fase di centrifugazione.
Nota: Mark direzione della forza centrifuga sul tubo, in modo da poter rilevare il pellet di DNA più facilmente quando la resa del DNA è bassa.
19.a. Togliere l'alcol isopropilico per decantazione o aspirazione a vuoto. Fare attenzione a non disturbare il pellet di DNA.
Nota: Rimuovere l'alcool isopropilico non appena la centrifugazione è stato completato. State molto attenti a non perdere il pellet di DNA. La dimensione del DNA pellet può variare notevolmente a seconda del tipo di terreno, da un ben visibile (~ 9 mm di diametro) a malapena visibili. Si consiglia di rimuovere i residui di alcool isopropilico, aspirando lungo la parete del tubo accuratamente in modo da non aspirazione il pellet di DNA.
20.a. Secco DNA pellet a temperatura ambiente per 5 - 20 min.
Nota: non troppo secco DNA a pellet, altrimenti sarà difficile ridisciogliere il DNA.
21.a. Risospendere il pellet di DNA in 200 l TE. Mescolare picchiettando leggermente. Trasferire la soluzione di DNA in 1,5 ml di tubo. Tenere il tubo a 4 ° C per una notte in modo da sciogliere completamente il DNA.
Nota: a seconda delle dimensioni del pellet, è possibile regolare il volume di TE da aggiungere. Di solito 200-400 ml di TE funziona bene.
* In alternativa seguire la procedura 15b - 21.b.
15.b. Prelavaggio uno Amicon ® Ultra-15 dispositivi centrifuga filtro, aggiungere 15 ml TE al dispositivo e centrifugare a 3500 x g per 10 min. Gettare il flow-through.
16.b. Posizionare la soluzione di DNA a partire dal punto 13 al pre-lavati filtro Amicon. Centrifugare a 3500 x g fino a quando il volume del DNA è ridotto a 200 - 500 microlitri. Gettare il flow-through.
17.b. Lavare il DNA con TE due volte, aggiungere 10 ml TE ai dispositivi di filtro Amicon. Centrifugare a 3500 x g fino a quando il volume del DNA è ridotto a circa 200 l. Gettare il flow-through. Ripetere ancora una volta.
18.b. Trasferire la soluzione di DNA sul filtro a un nuovo tubo di 1,5 ml.
19.b. Aggiungere 40 microlitri TE al filtro Amicon. Lavare entrambi i lati delle membrane filtro pipettando su e giù al fine di recuperare eventuali residui di DNA sul filtro. Aggiungere a questa soluzione di lavaggio per il tubo a 18.b. passo
20.b. Se necessario, il DNA può essere ulteriormente concentrato da microcontrollore ® Ultracel YM-30 Unità di centrifuga Filtro; pre-lavare il filtro con l'aggiunta di 200 ul TE e la centrifugazione a 10000 x g per 7 minuti. Aggiungere la soluzione di DNA al filtro e centrifugare a 5000 x g per 1 min. Ripetere centrifugazione fino a quando la quantità di soluzione di DNA del filtro ridotto al 50 microlitri circa.
Nota: volume del campione Massimo iniziale per microcontrollore filtro è 500 microlitri. Non centrifugare a velocità superiori a 14000 x g. Non più di centrifuga fino a quando la membrana si asciuga completamente. Assicurarsi che alcuni liquidi copre ancora il filtro dopo la centrifugazione. Se avete più di centrifugati e la membrana è asciutto, poi aggiungere 15 microlitri TE, agitare delicatamente per 30 secondi, e passare al punto 21.b.
21.b. Posizionare l'unità filtro a testa in giù in un tubo nuovo microcontrollore e centrifugare a 1000 xg per 3 minuti per recuperare il DNA.
22. Quantificare il DNA da TAE gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V per 4 ore), e da spettrofotometro NanoDrop o Pico-verde di analisi e lettore di piastre.
Nota: importo del DNA può essere valutato confrontando il gruppo campione alla banda marcatore con concentrazione nota (High marcatore molecolare del DNA o λHindIII) sul gel.
23. Controllare l'integrità del DNA alto peso molecolare mediante elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE) con l'1%, 1xTAE gel (Per maggiori dettagli consultare la Fase II, part2 a http://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 , doi: 10.3791/1387 da Taupp et al 2009)..
Nota: è possibile l'uso regolare del gel di agarosio per questo scopo QC invece di bassa fusione agarosio. In breve, le condizioni di elettroforesi sono le seguenti: 2-250 KB, 6 volt, iniziale tempo di commutazione: 5 sec, tempo finale di commutazione: 15 sec, una durata di 12 ore a 14 ° C. Oro SYBR colorazione per un'ora di visualizzare il DNA sul gel.
24. Se il peso molecolare di DNA estratto sono soddisfacenti, quindi procedere alla fase successiva CsCl centrifuga gradiente. In alternativa, il DNA possono essere conservati a -20 ° C o -80 ° C prima della centrifuga CsCl.
La dimensione media del DNA dovrebbe essere la pari o superiore a 36 Kb, se si vuole costruire una grande biblioteca metagenomica di DNA.
Parte II. Purificazione del DNA mediante ultracentrifugazione gradiente di cloruro di cesio
Preparazione di centrifuga: 1,5 - 2 ore
Centrifugazione passo: 18 ore
Rimozione di etidio bromuro (EtBr) e concentrando il DNA dopo la centrifugazione: 3 ore
Procedura
Per ulteriori informazioni, consultare Wright et al. . 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , doi: 10.3791/1352
Risultati rappresentante / Esito
La quantità totale di DNA genomico isolato da 2 g di suolo forestale organici (O orizzonte) e orizzonti minerali (Ae, AB, e Bt orizzonti) (prelevati dal suolo produttività a lungo termine (LTSP), sito che si trova a Skulow lago, BC, Canada e gestito da BC Ministero delle Foreste e Range) variava da 10 mg a 180 mg. La dimensione media di DNA isolato era di solito tra i 40 - 60 KB (Figura 1). Il rapporto di assorbanza a 260 nm nm/280 era tra 1,3-1,6 e ci fu un picco a 230 nm, che possono indicare contaminazione acidi umici spesso osservati in campioni di suolo. La centrifugazione in gradiente di CsCl drasticamente ridotto questa contaminazione e anche aumentato il rapporto di 260/280 a 1,8-1,9 come mostrato nella Figura 2a e 2b.
Figura 1. Immagini PFGE del DNA genomico estratto prima ultracentrifugazione CsCl. lane1: 1 kb marcatore 100 ng, corsia 2: λHind III, punto 100 ng, corsia 3: λHind III marcatore 250 ng, corsia 4: λHind III marcatore 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb marcatore 100 ng, corsia 6 e 7: genomico DNA isolato dall'orizzonte terreno Ae minerali, corsia 8 e 9: DNA genomico isolato dal AB orizzonte minerale del terreno nel sito LTSP trova Skulow lago, BC
Chromograms Figura 2. Di DNA genomico rilevato dal spettrofotometro prima (A) e dopo ultracentrifugazione CsCl (B). Si noti la riduzione del valore di assorbanza alla lunghezza d'onda 230 nm dopo ultracentrifugazione CsCl, che indica un miglioramento della qualità del DNA genomico. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l'innovazione, la Columbia Britannica Conoscenza di sviluppo regionale, Genome British Columbia e la British Columbia Ministero delle Foreste e Gamma per sostenere gli studi in corso di produttività del suolo forestale. SL è stato sostenuto da una borsa di studio del Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| *Denaturing solution: 10 ml in total | |||
| Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g | |||
| 1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl | |||
| 0.5M EDTA, 20 μl | |||
| Add water to 9.95 ml in total. | |||
| Autoclave. | |||
| Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution) | |||
| Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use. | |||
| **Extraction Buffer | |||
| 1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml | |||
| 1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml | |||
| 0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml | |||
| 5 M NaCl, 300 ml | |||
| Autoclave and keep it at room temperature. | |||
| Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. | |||
| * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 | |||
| Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended. | |||
References
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
