Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

Summary

Eine Methodik, um mit hohem Molekulargewicht und hoher Qualität genomischer DNA aus mikrobiellen Gemeinschaft zu isolieren beschrieben.

Abstract

Der Boden Mikrobiom ist ein riesiges und relativ unerforscht Reservoir von genomischer Diversität und metabolische Innovation, die eng mit Nährstoff-und Energieflüsse innerhalb terrestrische Ökosysteme verbunden ist. Anbau-unabhängigen Umweltgutachter genomische, auch als Metagenom bekannt, versprechen Ansätze beispiellosen Zugang zu diesen genetischen Informationen in Bezug auf Weg Wiederaufbau und funktionelles Screening für hochwertige therapeutische und Umwandlung von Biomasse-Prozesse. Doch der Boden Mikrobiom immer noch eine Herausforderung vor allem auf die Schwierigkeiten bei der Beschaffung hochmolekulare DNA von ausreichender Qualität für große einfügen Bibliothek Produktion. Hier stellen wir ein Protokoll für die Gewinnung von hohem Molekulargewicht, mikrobiellen Gemeinschaft genomischer DNA aus Böden und Sedimenten. Die Qualität der isolierten genomischen DNA ist ideal für den Bau großer einfügen Umwelt genomische Bibliotheken für Downstream-Sequenzierung und Screening-Anwendungen.

Das Verfahren beginnt mit Zell-Lyse. Zellwände und Membranen von Mikroben werden sowohl von mechanischen (Schleifen) und chemische Kräfte (β-Mercaptoethanol) lysiert. Genomic DNA wird dann isoliert mit Extraktionspuffer, Chloroform-Isoamylalkohol und Isopropylalkohol. Die Puffer für die Lyse und Extraktion Schritte eingesetzt werden, umfassen Guanidinisothiocyanat und Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB), um die Integrität der hochmolekularen genomische DNA zu erhalten. Abhängig von Ihrer nachgeschalteten Anwendung kann der isolierten genomischen DNA weiter aufgereinigt werden mit Cäsiumchlorid (CsCl)-Ultrazentrifugation, die Verunreinigungen einschließlich Huminsäuren reduziert. Das erste Verfahren, Extraktion, dauert ca. 8 Stunden, ohne DNA-Quantifizierung Schritt. Die CsCl Gradienten-Ultrazentrifugation, ist ein 2 Tage-Prozess. Während des gesamten Verfahrens, genomische DNA vorsichtig behandelt werden sollte, um Scherung zu verhindern, vermeiden Sie starke Verwirbelung und repetitive rauen Pipettieren.

Protocol

Teil I: Die Extraktion von DNA

Verfahren

1. 8 Stunden benötigt werden, für die Verarbeitung von 6 Proben ohne Quantifizierung von DNA.

Bevor Sie die Extraktion zu starten, werden Sie vor Kälte Mörtel, Pistill und Spatel in einem -20 ° C Gefrierschrank oder mit flüssigem Stickstoff benötigen. Auch vor Kälte 50 ml Röhrchen mit 20 ml Chloroform Isoamylalkohol (24:1) auf Eis. Stellen Sie die Hybridisierung Backofen auf 65 ° C vorheizen. Überprüfen Sie CTAB-Lösung, wenn es warm kristallisiert wird auf 60 ° C, um die Kristalle schmelzen. Füllen Sie das Denaturierungslösung und Extraktionspuffer, indem Sie die letzten Zutaten kurz vor der Extraktion (siehe Rezept unten) beginnen. Führe alle Extraktionsverfahren in einem Abzug.

2. Bereiten Sie die Denaturierungspuffer und Extraktionspuffer.
Hinweis: Um die DNA-Ausbeute zu maximieren, ist es wichtig, genau zu machen Puffer den Anweisungen folgen.

3. Platz 2 g Boden in einem vorgekühlten Mörser.
Hinweis: Der Boden in dem Gebiet gesammelt haben, sollten auf Trockeneis für den Transport eingefroren und bei -80 ° C. Tauwetter und Sieb Boden mit einem 2 mm Sieb vor der DNA-Extraktion. Sie können den Grundbetrag von Boden bis zu 10 g. erhöhen

4. 1 ml der denaturierenden Lösung auf den Boden.

5. Freeze und schleifen den Boden in flüssigem N ₂ mit einem Stößel, bis der Boden Partikel pulverförmigen und homogenes Aussehen anstreben. Wiederholen Sie das Einfrieren und Schleifen zweimal.
Hinweis: Bewahren Sie die Bodenprobe eingefroren während des Schleifens, mit genügend flüssiger Stickstoff zur Deckung der Bodenprobe. Leichte Schmelzen während des Schleifens ist akzeptabel.

6. Übertragen Sie die in das Erdreich in einen 50 ml konischen Rohr mit einem vorgekühlten Spatel.
Hinweis: Der Boden Bodenprobe kann bei -80 ° C an dieser Stelle, wenn nötig gespeichert werden.

7. Add 9 ml Extraktionspuffer. Um die Lösung und Boden, kurz vortexen bei geringer Geschwindigkeit mischen.
Hinweis: Um sicherzustellen, dass die Puffer ist homogen, warm bei 60 ° C für 10-15 Minuten vor dem Gebrauch. Halten Sie den Rest der Puffer bei 60 ° C während der Extraktion. Vortex bei der Geschwindigkeit 8 (auf einer Skala, wobei 10 das Maximum).

8. Inkubieren für 40 min bei 65 ° C in einem Hybridisierungsofen. Während der Inkubation kontinuierlich drehen die Rohre bei niedrigster Drehzahl, oder durch vorsichtiges Umdrehen der Röhrchen alle 10 min.
Hinweis: Legen Sie das Rohr horizontal in einem Hybridisierungsofen, damit Puffer Boden über eine große Fläche zu kontaktieren. Die Lösung kann ein wenig viskosen während der Inkubation zu suchen.

9. Zentrifuge bei 1800 x g, 10 min bei 10 bis 14 ° C. Transfer in die vorgekühlte 50 ml konische Röhrchen mit 20 ml Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) den Überstand auf Eis zu halten.
Hinweis: Wenn Sie Überstand zu übertragen, darauf achten, nicht die organische Schicht (untere Schicht) zu stören. Lassen Sie 1-2 ml Überstand, wenn es um nur saubere Überstand sammeln notwendig ist. Oft sehen Sie eine beige Schicht (ca. 1-3 mm dick) auf der Oberseite des Überstandes. Bitte nicht stören diese Schicht bei der Erhebung der Überstand. Versuchen Sie, die Spitze entlang der Rohrwand slide zu einem Bruch dieser beige Schicht zu verhindern. Wenn der Überstand zu trübe ist, wiederholen Sie die Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion ein weiteres Mal auf den Überstand. Verwenden Sie keine Einweg-Kunststoff-Pipetten bei der Übertragung von Chloroform, wie Chloroform wird die Kunststoffschmelze. Verwenden Sie eine Glaspipette oder einem Glas-Messzylinder, oder gießen Chloroform direkt in 50 ml konische Röhrchen.

10. Auszug des Bodens Pellets 2 weitere Male;

10.1. 5 ml Extraktionspuffer in den Boden Pellets, vorsichtig mischen mit 1 ml Spitze von kurzen Vortexen bei niedriger Geschwindigkeit an.
Hinweis: Shake und mischen Sie die Puffer vor dem Gebrauch.

10.2. Inkubation bei 65 ° C für 10 min in Hybridisierungsofen. Zentrifuge bei 1800 x g, 10 min bei 10 bis 14 ° C.
Überstand in die Röhre bei Schritt 9 fort. Halten Sie das Röhrchen mit gesammelten Überstand und Chloroform-Isoamylalkohol auf Eis während der Extraktion.
Hinweis: Achten Sie darauf, fügen Sie den Überstand in das gleiche Rohr ohne Kreuz Vermischung zwischen den Proben.

10.3. Wiederholen 9.1 und 9.2 noch einmal.

11. Mit einem Drehteller, sehr sanft Rock die Röhre, die die gesammelten Überstand (14-19 ml) und Chloroform-Isoamylalkohol bei 1,25 min für 10 min enthält.
Hinweis: Schließen Sie den Deckel sehr fest, um ein Auslaufen zu verhindern. Legen Sie ein Papiertuch auf dem schaukelnden Platte, bevor Sie das Rohr so ​​eventuelle Lecks leicht erkannt werden kann Platz.

12. Zentrifuge bei 1800 x g, 20 min bei 10 bis 14 ° C.

13. Transfer wässrige Phase in ein neues Röhrchen.
Hinweis: Bitte nicht stören der Interphase zwischen der wässrigen Phase (obere Schicht) und die organische Schicht (untenSchicht), wenn Sie den Überstand zu übertragen. Lassen Sie ca. 1,5 bis 2 ml Überstand Sammlung nur saubere Überstand zu gewährleisten.

14. Stellen Sie die DNA mit Isopropanol (Schritt 15.a - 21.a). Alternativ können Sie Amicon ® Ultra-15 Zentrifugalfilter Devices (Schritt 15.b - 21.b), wenn Sie sehr geringe Menge an Biomasse in Ihrer Probe, die kaum sichtbare Pellet durch Isopropylalkohol Niederschläge, die nur schwer wieder erholen wird produzieren erwarten.

15.a Setzen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen Ultrazentrifuge.

16.a. Add Isopropylalkohol, um die gesammelten Überstand bei einem Volumenverhältnis von 0,6:1. Kehren Sie die Röhren vorsichtig ein paar Mal zu mischen.

17.a Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur.

18.a. Zentrifugation bei 16000 x g, 20 min bei 20 bis 25 ° C. Sicherstellen, dass die Gewichte aller Röhren sind gut vor dem Zentrifugationsschritt ausgeglichen.
Hinweis: Markieren Sie die Richtung der Zentrifugalkraft auf die Tube, so kann man das DNA-Pellet leichter erkennen, wenn die DNA-Ausbeute ist gering.

19.a. Entfernen Sie Isopropylalkohol durch Dekantieren oder Vakuum abgesaugt. Achten Sie darauf, das DNA-Pellet stören.
Hinweis: Entfernen Sie Isopropylalkohol sobald Zentrifugation abgeschlossen ist. Seien Sie sehr vorsichtig, nicht auf die DNA-Pellet zu verlieren. Die Größe der DNA-Pellet kann stark variieren in Abhängigkeit von der Bodenart, von einer deutlich sichtbaren (~ 9 mm Durchmesser) kaum sichtbar. Es wird empfohlen, den Rückstand von Isopropylalkohol durch Absaugen an der Wand des Röhrchens vorsichtig, um nicht zum Saugen aus der DNA-Pellet entfernen.

20.a. Dry DNA-Pellet bei Raumtemperatur für 5 bis 20 min.
Hinweis: Nicht über trockene DNA-Pellet, sonst wird es schwierig sein, die DNA wieder auflösen.

21.a. Resuspendieren DNA-Pellet in 200 ul TE. Mix it durch leichtes Klopfen. Übertragen Sie die DNA-Lösung in 1,5 ml-Tube. Halten Sie das Röhrchen bei 4 ° C über Nacht, um sich vollständig auflösen DNA.
Hinweis: Je nach Größe der Pellets, können Sie die Lautstärke des TE passen hinzuzufügen. In der Regel 200 bis 400 ul TE funktioniert gut.

* Alternativ folgen Sie den Schritten 15.b - 21.b.

15.b. Vorwäsche einer Amicon ® Ultra-15 Zentrifugalfilter Devices; 15 ml TE an das Gerät und Zentrifuge bei 3500 x g für 10 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.

16.b. Legen Sie die DNA-Lösung aus Schritt 13 an den pre-washed Amicon-Filter. Zentrifuge bei 3500 x g, bis die DNA auf 200 reduziert wird - 500 ul. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.

17.b. Waschen Sie die DNA mit TE zweimal, 10 ml TE zum Amicon-Filter-Geräte. Zentrifuge bei 3500 x g, bis die DNA-Menge auf etwa 200 ul reduziert wird. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Wiederholen Sie noch einmal.

18.b. Übertragen Sie die DNA-Lösung auf dem Filter in ein neues 1,5-ml-Tube.

19.b. Zugabe von 40 ul TE zum Amicon-Filter. Wash beiden Seiten der Filtermembranen durch Auf-und Abpipettieren, um etwaige DNA Rückstand auf dem Filter zu erholen. Fügen Sie diese Waschlösung auf das Rohr in Schritt 18.b.

20.b. Falls erforderlich, kann die DNA weiter konzentriert werden, indem Microcon ® Ultracel YM-30 Zentrifugalfilter Unit; Vorwäsche des Filters durch Zugabe von 200 ul TE und Zentrifugieren bei 10000 x g für 7 Minuten. Fügen Sie die DNA-Lösung auf dem Filter und Zentrifuge bei 5000 x g für 1 min. Wiederholen Sie die Zentrifugation bis die Menge der DNA-Lösung auf dem Filter reduziert auf 50 ul rund.
Hinweis: Der maximale Probenvolumen für Microcon Filter 500 ul. Nicht bei Geschwindigkeiten über 14000 x g. Zentrifuge Nicht über Zentrifuge, bis die Membran vollständig trocknet. Stellen Sie sicher, dass etwas Flüssigkeit bedeckt die Filter nach dem Zentrifugieren. Wenn Sie über zentrifugiert und die Membran trocken ist, fügen Sie dann 15 ul TE leicht bewegen für 30 Sekunden, und fahren Sie mit Schritt 21.b.

21.b. Platzieren Sie die Filtereinheit kopfüber in eine neue Microcon Rohr und Zentrifuge bei 1000 xg für 3 min, um die DNA zu erholen.

22. Quantifizierung der DNA durch TAE-Gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V für 4 Stunden) und durch Nanodrop Spektralphotometer oder Pico-Grün-Test und Platten-Lesegerät.
Hinweis: DNA-Menge kann durch den Vergleich der Probe-Band um den Marker Band mit bekannter Konzentration (High molekulare DNA-Marker oder λHindIII) auf dem Gel abgeschätzt werden.

23. Überprüfen Sie die Integrität der DNA mit hohem Molekulargewicht mit Pulsed Field Gel-Elektrophorese (PFGE) mit 1%, 1xTAE Gel (Für weitere Details siehe Step II, part2 bei http://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 , doi: 10.3791/1387 durch Taupp et al 2009)..
Hinweis: Sie können regelmäßig Agarosegel für diese QC Zweck anstelle von niedrig schmelzenden Agarose verwenden. Kurz gesagt, sind Elektrophorese-Bedingungen wie folgt: 2-250 kb, 6 Volt, erste Schaltzeit: 5 Sek., letzte Schaltzeit: 15 sec, für 12 Stunden bei 14 ° C betrieben SYBR Gold-Färbung für eine Stunde, um die DNA auf dem Gel sichtbar zu machen.

24. Wenn die Molekulargewichte der extrahierten DNA zufriedenstellend sind, dann an den folgenden CsCl-Gradienten Zentrifuge Schritt fort. Alternativ können DNA bei -20 ° C oder -80 ° C gelagert werden, bevor die CsCl Zentrifuge.
Die mittlere Größe der DNA sollte das gleiche sein oder mehr als 36 Kb, wenn Sie eine große einfügen metagenomische DNA-Bibliothek aufbauen wollen.

Part II. DNA-Aufreinigung mittels Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation

Vorbereitung der Zentrifuge: 1,5 - 2 Stunden
Zentrifugationsschritt: 18 Stunden
Entfernen Ethidiumbromid (EtBr) und die Konzentration DNA nach Zentrifugation: 3 Stunden

Verfahren

Weitere Informationen hierzu finden Wright et al. . 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , doi: 10.3791/1352

Repräsentative Ergebnisse / Outcome

Der Gesamtbetrag von genomischer DNA aus 2 g Waldboden organischen (O-Horizont) und mineralischen Horizonte (Ae, AB, und Bt-Horizonte) (abgetastet aus dem Long Term Soil Productivity (LTSP) Website unter Skulow See, BC, Kanada isoliert und wird von BC Ministry of Forests und Range) reichten von 10 mg bis 180 mg. Die mittlere Größe der isolierten DNA wurde in der Regel zwischen 40 bis 60 kb (Abbildung 1). Das Verhältnis der Absorption bei 260 nm nm/280 wurde zwischen 1,3 bis 1,6, und es gab einen Peak bei 230 nm, die Huminsäure Kontamination oft in Bodenproben beobachtet hinweisen können. Die CsCl-Gradienten-Zentrifugation drastisch reduziert diese Verunreinigung und erhöhte auch das Verhältnis von 260/280 auf 1,8 bis 1,9, wie in Abbildung 2a und 2b gezeigt.

Abbildung 1. PFGE Bilder von der extrahierten genomischen DNA vor CsCl Ultrazentrifugation. lane1: 1 kb-Marker 100 ng, Spur 2: λHind III Marker 100 ng, Spur 3: λHind III Marker 250 ng, Spur 4: λHind III Marker 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb Marker 100 ng, Spur 6 und 7: genomische DNA aus dem Mineralboden Horizont Ae, Spur 8 und 9 isoliert: genomische DNA aus dem Mineralboden Horizont AB an der LTSP Website befindet Skulow See, BC isoliert

Abbildung 2. Chromograms von genomischer DNA von Spektralphotometer, bevor erkannt (A) und nach CsCl Ultrazentrifugation (B). Beachten Sie die Reduzierung der Extinktionswert bei der 230 nm Wellenlänge nach CsCl Ultrazentrifugation, die Verbesserung in der genomischen DNA Qualität zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
*Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl
0.5M EDTA, 20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution)
Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.
**Extraction Buffer
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml
5 M NaCl, 300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C.
* 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0
Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.