Summary
En metod för att isolera med hög molekylvikt och hög kvalitet genomisk DNA från mark mikrobiella beskrivs.
Abstract
Marken microbiome är en stor och relativt outforskad reservoar av genomiska mångfald och metabola innovation som är intimt förknippad med närings-och energiflödet i terrestra ekosystem. Odling-oberoende miljö genomisk, även känd som metagenomic närmar lovar oöverträffad tillgång till denna genetisk information med avseende på väg återuppbyggnad och funktionell screening för högt värde terapeutiskt och biomassa omvandlingsprocesser. Dock fortfarande jorden microbiome fortfarande en utmaning stor del beror på svårigheten att få hög molekylvikt DNA av tillräckligt hög kvalitet för stora in-biblioteket produktion. Här presenterar vi ett protokoll för att utvinna hög molekylvikt, mikrobiella genomisk DNA från mark och sediment. Kvaliteten på isolerade arvsmassans DNA är idealisk för att bygga stora sätter miljö-genomiska bibliotek för nedströms sekvensering och screening program.
Förfarandet inleds med cell-lys. Cellväggar och membran av mikrober lyseras av både mekanisk (slipning) och kemiska krafter (β-merkaptoetanol). Genomisk DNA är då isoleras med hjälp av extraktionsbuffert, kloroform-Isoamyl alkohol och isopropylalkohol. De buffertar som används för lys och steg utvinning inkluderar guanidin isothiocyanat och hexadecyltrimethylammonium bromid (CTAB) för att bevara integriteten i hög molekylvikt arvsmassans DNA. Beroende på din nedströms ansökan kan de isolerade genomiska DNA renas ytterligare med hjälp av cesiumklorid (CsCl) gradient ultracentrifugering, som minskar föroreningar, särskilt humus. Det första förfarandet, extraktion, tar ca 8 timmar, med undantag av DNA-kvantifiering steg. Den CsCl lutning ultracentrifugering, är en två dagars process. Under hela förfarandet bör genomisk DNA behandlas varsamt för att förhindra klippning, undvika allvarliga vortexa och repetitiva hårda pipettering.
Protocol
Del I: Extraktion av DNA
Förfarande
1. 8 timmar behövs, för beredning 6 prover utom kvantifiering av DNA.
Innan du börjar utvinning, måste du pre-chill murbruk, mortel och stekspade i -20 ° C frys eller med hjälp av flytande kväve. Även pre-chill 50 ml rör som innehåller 20 ml kloroform Isoamyl alkohol (24:1) på is. Sätt hybridisering ugnen till 65 ° C till förvärmning. Kontrollera CTAB lösning, om det är kristalliserad varmt till 60 ° C för att smälta kristaller. Fyll i denaturering lösningen och extraktionsbuffert genom att lägga de sista ingredienserna precis innan du startar extraktion (se recept nedan). Utföra alla extraktion i dragskåp.
2. Förbered denaturera buffert och extraktionsbuffert.
OBS: För att maximera DNA avkastningen, är det viktigt att just göra buffertar följa instruktionerna.
3. Plats 2 g jord i en pre-kyld murbruk.
Observera: Jord samlas in inom området frysas på torris för transport och förvaring vid -80 ° C. Tina och sikt jorden med ett 2 mm såll innan DNA-extraktion. Du kan öka börjar mängd jord upp till 10 g.
4. Tillsätt 1 ml av denaturering lösning på jorden.
5. Frys och slipa jorden i flytande N 2 med en mortelstöt tills jordpartiklar ser pudrig och homogen. Upprepa frysning och slipning två gånger.
Anmärkning: Behåll jordprovet frusna under slipning, med tillräckligt flytande kväve för att helt täcka jordprovet. Lätt smälta under slipningen är acceptabel.
6. Överför marken jorden till en 50 ml koniska rör med hjälp av en pre-kyld spatel.
Obs: Marken jordprov kan förvaras vid -80 ° C på denna punkt, om det behövs.
7. Tillsätt 9 ml extraktionsbuffert. För att blanda lösningen och jord, vortex kort på låg hastighet.
OBS: För att säkerställa att bufferten är homogen, värma den vid 60 ° C i 10-15 minuter före användning. Håll resten av buffert vid 60 ° C i hela utvinningen. Vortex med hastighet 8 (på en skala där 10 är högsta).
8. Inkubera 40 minuter vid 65 ° C i en hybridisering ugn. Under inkubation, kontinuerligt roterar rören på lägsta hastighet, eller försiktigt vändas rören var 10 min.
Obs: Placera röret horisontellt i en hybridisering ugn så att bufferten för att kontakta jord över en stor yta. Lösningen kan se lite trögflytande under inkubationstiden.
9. Centrifugera vid 1800 x g, i 10 min vid 10 - 14 ° C. Överför supernatanten i före kyld 50 ml koniska rör som innehåller 20 ml kloroform-Isoamyl alkohol (24:1), håller på is.
Obs: När du överför supernatanten noga med att inte störa det organiska skiktet (understa lagret). Lämna 1-2 ml av supernatanten om det är nödvändigt för att samla in bara rent supernatant. Du kan ofta se en beige skikt (ca 1-3 mm i tjocklek) på toppen av supernatanten. Stör inte detta lager när du hämtar supernatanten. Försök att skjuta toppen längs röret väggen för att förhindra brott av detta beige lager. Om supernatanten är för grumligt, upprepa kloroform-Isoamyl alkohol utvinning ett mer tid på supernatanten. Använd inte disponibel plastpipetter vid överföring av kloroform, som kloroform kommer att smälta plasten. Använd en glaspipett, eller ett glas mätcylinder, eller häll kloroform direkt i 50 ml koniska rör.
10. Utdrag jorden pellets 2 gånger;
10,1. Tillsätt 5 ml buffert utvinning till jorden pellets, blanda försiktigt med 1 ml spetsen följt av korta vortexa i låg hastighet.
OBS: Skaka och blanda buffert före användning.
10,2. Inkubera vid 65 ° C i 10 min i hybridisering ugn. Centrifugera vid 1800 x g, i 10 min vid 10 - 14 ° C.
Överför supernatanten till röret på steg 9. Håll röret med insamlade supernatanten och kloroform-Isoamyl alkohol på isen vid utvinning.
Obs: Se till att du lägger supernatanten till samma rör utan att korsa blandning mellan proverna.
10,3. Upprepa 9,1 och 9,2 en gång till.
11. Med hjälp av en roterande platta, mycket försiktigt klippa röret där de insamlade supernatanten (14-19 ml) och kloroform-Isoamyl alkohol på 1,25 varv i 10 min.
Obs: Stäng locket mycket hårt för att förhindra läckage. Lägg en pappershandduk på den gungande platta innan du placerar röret så eventuella läckage lätt kan upptäckas.
12. Centrifugera vid 1800 x g i 20 minuter vid 10 - 14 ° C.
13. Överför vattenfasen till ett nytt rör.
OBS: Använd inte störa interfas mellan vattenfasen (översta lagret) och organiska skikt (bottenlager) när du överför supernatanten. Lämna cirka 1,5 2 ml supernatant att säkerställa uppbörden av enbart rena supernatant.
14. Återvinn DNA med isopropylalkohol (steg 15.a - 21.a). Du kan också använda Amicon ® Ultra-15 Radialfläkt Filterskydd (steg 15.b - 21.b) om du förväntar dig mycket låga mängden biomassa i ditt prov, som kommer att producera knappt synliga pellets av isopropylalkohol nederbörd som är svårt att återhämta sig.
15.a. Placera supernatanten till ett nytt rör ultracentrifugen.
16.a. Lägg isopropylalkohol den insamlade supernatanten vid en volym förhållandet 0.6:1. Vänd rören försiktigt några gånger för att blanda.
17.a Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
18.a. Centrifugera på 16000 x g, i 20 minuter vid 20 - 25 ° C. Se till vikter av alla rören är balanserade i god tid innan centrifugering steg.
Obs: Markera riktning centrifugalkraften på tuben, så du kan upptäcka DNA pellets lättare när DNA avkastningen är låg.
19.a. Ta bort isopropylalkohol genom dekantering eller vakuum suga. Var noga med att inte störa DNA pelleten.
Obs: Ta bort isopropylalkohol så fort centrifugeringen är klar. Var mycket noga med att inte förlora DNA pelleten. Storleken av DNA pellets kan variera beroende på vilken typ av jord, från en väl synlig (~ 9 mm i diameter) till knappt synliga. Det rekommenderas att ta bort rester av isopropylalkohol genom att suga längs väggen av röret försiktigt för att inte sug ut DNA pelleten.
20.a. Torr DNA pellets i rumstemperatur i 5 - 20 min.
Obs: Använd inte över torrt DNA pellets, annars blir det svårt att lös upp DNA.
21.a. Resuspendera DNA pelleten i 200 l TE. Blanda genom att försiktigt packas. Överför DNA-lösningen till 1,5 ml rör. Håll röret vid 4 ° C över natten för att fullt ut lösa upp DNA.
Obs: Beroende på storleken av pellets, kan du justera volymen på TE för att lägga till. Vanligtvis 200 till 400 ìl av TE fungerar bra.
* Alternativt följa stegen 15.b - 21.b.
15.b. Förtvätt en Amicon ® Ultra-15 Radialfläkt Filterskydd, tillsätt 15 ml TE till enheten och centrifugera vid 3500 x g, i 10 min. Kassera genomströmning.
16.b. Placera DNA-lösningen från steg 13 till förtvättad Amicon filter. Centrifugera vid 3500 x g tills DNA volymen reducerats till 200 till 500 l. Kassera genomströmning.
17.b. Tvätta DNA med TE två gånger, tillsätt 10 ml TE till Amicon filtret enheter. Centrifugera vid 3500 x g tills DNA volymen reducerats till ca 200 l. Kassera genomströmning. Upprepa en gång till.
18.b. Överför DNA lösningen på filtret till ett nytt 1,5 ml rör.
19.b. Tillsätt 40 l TE till Amicon filtret. Tvätta båda sidor av filtret membran genom att pipettera upp och ned för att återkräva DNA rester på filtret. Lägg till detta tvättlösning till röret i steg 18.b.
20.b. Vid behov kan DNA ytterligare koncentreras genom Microcon ® Ultracel YM-30 Radialfläkt filter, förtvätt filtret genom att tillsätta 200 l TE och centrifugering till 10000 x g 7 minuter. Lägg till DNA-lösningen till filtret och centrifugera vid 5000 x g 1 min. Upprepa centrifugeringen tills mängden DNA lösningen på filtret reducerats till 50 l ca.
OBS: Max första urvalet volym för Microcon filtret är 500 l. Gör centrifugen inte vid hastigheter över 14 tusen x g. Inte över centrifugen förrän membranet torkar helt. Se till att vätska fortfarande täcker filtret efter centrifugering. Om du över centrifugeras och membranet är torrt, lägg sedan till 15 l TE, agitera försiktigt i 30 sekunder, och fortsätter till steg 21.b.
21.b. Placera aggregatet upp och ner i en ny Microcon rör och centrifugera vid 1000 xg under 3 min för att återvinna DNA.
22. Kvantifiera DNA genom TAE gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V under 4 timmar) och genom Nanodrop spektrofotometer eller Pico-gröna analysen och plattläsaren.
Obs: DNA beloppet kan uppskattas genom att jämföra provet bandet till markören bandet med känd koncentration (High molekylär DNA-markör eller λHindIII) på gelen.
23. Kontrollera integriteten för hög molekylvikt DNA med Pulsade Elektrofores Field Gel (PFGE) med 1%, 1xTAE gel (För mer information finns i steg II, part2 på http://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387 , doi: 10.3791/1387 av Taupp et al 2009)..
Notera: Du kan använda vanliga agarosgel för QC syfte i stället för låg smältpunkt agaros. I korthet, elektrofores förhållanden är följande: 2-250 kb, 6 volt, initial byta tid: 5 sek, sista byte: 15 sek, som körts i 12 timmar vid 14 ° C. SYBR Guld färgning i en timme för att visualisera DNA på gelen.
24. Om molekylvikter på extraherat DNA är tillfredsställande, sedan vidare till följande CsCl gradient centrifugering steg. Alternativt kan DNA förvaras vid -20 ° C eller -80 ° C innan CsCl centrifugen.
Medianvärdet för storleken på DNA ska vara lika med eller större än 36 Kb, om du vill bygga en stor sätter bibliotek metagenomic DNA.
Del II. DNA-rening med hjälp av cesium ultracentrifugering klorid lutning
Beredning av centrifugen: 1,5 - 2 timmar
Centrifugering steg: 18 timmar
Ta bort etidiumbromid (EtBr) och koncentrera DNA efter centrifugeringen: 3 timmar
Förfarande
För information, se Wright et al. . 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?id=1352 , doi: 10.3791/1352
Representativa resultat / Utfall
Den totala mängden genomiska DNA isolerat från 2 g av skogsmark organiskt (O horisont) och horisonter mineral (Ae, AB, och Bt horisonter) (prover från Long Term markens produktivitet (LTSP) webbplats ligger vid Skulow sjö, BC, Kanada och förvaltas av BC Ministeriet för skog och Range) varierade från 10 mg till 180 mg. Medianvärdet för storleken av isolerade DNA oftast mellan 40 - 60 kb (Figur 1). Förhållandet mellan absorbans vid 260 nm/280 nm var mellan 1,3 till 1,6 och det var en topp på 230 nm, vilket kan tyda humussyra kontamination ofta observeras i jordprover. Den CsCl gradient centrifugering minskat drastiskt denna förorening och ökade också förhållandet mellan 260/280 till 1,8 - 1.9 Eftersom visas i figur 2a och 2b.
Figur 1. PFGE bilder av den utvunna genomiska DNA innan CsCl ultracentrifugering. lane1: 1 kB markör 100 ng, körfält 2: λHind III markör 100 ng, körfält 3: λHind III markör 250 ng, Lane 4: λHind III markör 500 ng, lane5: Fosmid 36 kB markör 100 ng, körfält 6 och 7: genomiska DNA isoleras från mineraljorden horisonten Ae, körfält 8 och 9: genomisk DNA isolerat från mineraljorden horisonten AB på LTSP webbplats som finns Skulow sjö, BC
Figur 2. Chromograms av arvsmassans DNA detekteras med spektrofotometer före (A) och efter CsCl ultracentrifugering (B). Notera minskningen av absorbans värdet vid 230 nm efter CsCl ultracentrifugering, vilket tyder på förbättring av arvsmassans DNA-kvalitet. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka det kanadensiska institutet för innovation, British Columbia Kunskap utvecklingsfonden, Genome British Columbia och British Columbia ministeriet för skog och räckvidd för att stödja pågående studier av skogsmark produktivitet. SL fick stöd av ett stipendium från Tula stiftelsen finansierade Centrum för Mikrobiell diversitet och evolution.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| *Denaturing solution: 10 ml in total | |||
| Guanidine isothiocyanate (MW 118.16), 4.73 g | |||
| 1M Tris-HCl (pH 7.0), 100 μl | |||
| 0.5M EDTA, 20 μl | |||
| Add water to 9.95 ml in total. | |||
| Autoclave. | |||
| Add 50 μl 2-mercapt–thanol just before use. (5 μl of 2-mercapt–thanol per 1 ml Denaturing Solution) | |||
| Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use. | |||
| **Extraction Buffer | |||
| 1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*, 100 ml | |||
| 1M Tris-HCl [pH 7.0], 100 ml | |||
| 0.5M EDTA [pH 8.0], 200 ml | |||
| 5 M NaCl, 300 ml | |||
| Autoclave and keep it at room temperature. | |||
| Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. | |||
| * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 | |||
| Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended. | |||
References
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
