ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Methode voor Mycotoxine Detection

Summary

Een protocol om trichothecenen (mycotoxinen van zorg voor de gezondheid van de mens) met behulp van een nieuw ontwikkelde screening methode gebaseerd op een competitief immunochemische methode en een laatste elektrochemische detectie te detecteren is aangetoond.

Abstract

Immunoassays zijn een goed alternatief voor de duurdere en tijdrovende kwantitatieve HPLC of GC ^{1, 2} methoden voor het screenen detectie van gevaarlijke mycotoxinen in levensmiddelen. In dit protocol laten we zien hoe te fabriceren en te ondervragen een elektrochemische competitieve enzyme linked immunomagnetische assay gebaseerd op het gebruik van magnetische beads als vaste ondersteuning voor de immunochemische keten ³ en gezeefdrukt elektroden sensing platform.

Onze methode heeft tot doel vast te stellen het totale bedrag van de HT-2 en T-2-toxine, mycotoxinen die behoren tot de trichothecenen familie en van groot belang voor de gezondheid van de mens ^4. Het gebruik van een antilichaam kloon met een kruis reactiviteit van 100% naar HT-2 en T-2 maakt het mogelijk om gelijktijdig zowel de toxines te detecteren met een vergelijkbare gevoeligheid ^5.

De eerste stap van onze test is de coating stap waar we HT2-KLH conjugaat toxine immobiliseren op het oppervlak van de magnetische kralen. Na een blokkerende stap die nodig is om niet-specifieke absorptie te voorkomen, de toevoeging van een monoklonaal antilichaam kan de concurrentie tussen de geïmmobiliseerde HT-2 en gratis HT-2 of T-2 aanwezig is in het monster of opgelost in een standaard oplossing.

Aan het einde van de wedstrijd stap, het bedrag van monoklonale antilichaam gekoppeld aan het geïmmobiliseerde HT-2 zullen worden omgekeerd evenredig aan de hoeveelheid gif in de monsteroplossing.

Een secundaire antilichaam gelabeld met alkalische fosfatase (AP) wordt gebruikt om de binding tussen de specifieke antilichaam en het geïmmobiliseerde HT-2 te onthullen. De laatste meting stap wordt uitgevoerd door het droppen van een hoeveelheid van magnetische kraal ophanging, wat overeenkomt met een specifiek monster / standaard oplossing, op het oppervlak van een gezeefdrukte werkende elektrode, magnetische korrels worden geïmmobiliseerd en geconcentreerd door middel van een magneet precies onder de gezeefdrukt elektrode. Na twee minuten incubatie tussen magnetische kralen en een substraat voor AP, is de enzymatische product gedetecteerd door Differential Pulse voltammetrie (DPV) met behulp van een draagbaar instrument (PalmSens) ook in staat om automatisch acht metingen te starten binnen een interval van enkele seconden.

Protocol

1) Het blokkeren van gecoate magnetische Beads:

Ga als volgt te gecoate magnetische kralen te blokkeren:

1. Bereid een set van 2 ml Eppendorf buizen;
2. Homogeniseer (schudden, maar niet vortexen) gecoate magnetische kralen (zie de bijlage voor de bereiding van gecoate magnetische korrels) met behulp van het monster draaiende mixer;
3. Onmiddellijk na homogenisering, pipet 10 ul van gecoate magnetische korrels in elk afzonderlijk Eppendorf buizen;
4. Voeg 1 ml magere melk te blokkeren oplossing in elk eppendorfbuisje van de set;
5. Laat magnetische korrels incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op de draaiende mixer monster;
6. Verwijder de blokkering oplossing: om dit te doen plaats de buis in magnetische deeltjes concentrator met het magnetisch deel op voor de 2 min (zie magnetische korrels plakken op de laterale wand van de buis) zijn, dus wees pipet uit de bovendrijvende, waardoor kralen ongestoord;
7. Voeg 1 ml PBS buffer + NaN ₃ + BSA als opslag-oplossing voor elke buis;
8. Store gecoat en geblokkeerd magnetische korrels bij 4 ° C (let op dat gecoate magnetische korrels stabiel zijn voor ten minste 2 maanden bij 4 ° C);

2) Immunologische ketting op magnetische korrels voor de bouw van de ijklijn en de monsteranalyse

Ga als volgt te magnetische korrels klaar voor de meting zijn:

1. Neem een ​​Eppendorf buis (2 ml) van gecoate en geblokkeerd oplossing voor elk monsterextract je gaat analyseren;
2. Neem een ​​extra eppendorfbuisje voor elk werkgebied kalibratieoplossing;
3. Homogeniseer magnetische korrels gedurende 2 minuten op de roterende steekproef mixer voor gebruik;
4. Verwijder de opslag van vloeibaar met behulp van magnetische deeltjes concentrator;
5. Was de magnetische korrels drie keer met PBS / BSA wasoplossing. Verwijder wasmiddel;
6. Concurrentie stap: Voeg voor elke buis met daarin de gewassen magnetische korrels, 200μl van het monsterextract voorbereid; gebruik maken van een magnetische kraal buis voor elk monster. Herhaal deze procedure voor elke standaard-oplossing. Voeg 200 ul van monoklonaal antilichaam oplossing voor elk magnetische kraal buis. Laat magnetische korrels Incubeer gedurende een half uur op de draaiende mixer monster bij kamertemperatuur;
7. Verwijderen uit Eppendorf buisjes de oplossing voor de concurrentie-stap;
8. Labeling stap: Voeg 400μl van gelabeld secundair antilichaam aan elke magnetische bead eppendorfbuisje. Laat magnetische korrels Incubeer gedurende een half uur op de draaiende mixer monster bij kamertemperatuur;
9. Verwijder de etikettering oplossing van Eppendorf buizen;
10. Was de magnetische korrels drie keer met PBS / Tween ® 20 wasoplossing. Verwijder de vloeistof;
11. Resuspendeer met 100μl van DEA buffer elk aliquot van magnetische kralen. Nu zijn de magnetische korrels zijn klaar voor elektrochemische metingen stap;

3) Montage van PalmSens met multiplexer (Mux) opties

Let op: enzymatische hydrolyse product van substraat fouten het elektrode-oppervlak, om deze reden een nieuwe elektrode is nodig voor elke meting.

1. Sluit een PC laptop PalmSens via de seriële kabel;
2. Sluit de 9-DIN-stekker van CH8 multiplexer met PalmSens.
3. Sluit de seriële kabel van Achtkanaals Mux elektrisch contact met CH8 multiplexer;
4. Plaats elektrode strip op de acht magneet blok. Besteed aandacht aan elk magneet plaats onder elke werkdag elektroden (van nota, de noodzaak van een magneet voor elke elektrode is noodzakelijk omdat anders de magnetische deeltjes zullen niet worden geconcentreerd op de werkende elektrode gebied);
5. Steek de stekker in elektrodes strip in acht kanaals Mux elektrisch contact;

Voor DPV meting gebruik maken van de volgende parameters in de betreffende vakken:
E beginnen: 0 (V); E end: 0,6 (V); E stap: 0.016 (V); E pulse: 0.0339 (V); E conditionering: 0 (V); E depositie: 0 (V); Scan tarief : 0,1 (V / s); T pulse: 0.06 (s); T conditionering: 0 (s), T depositie: 0 (s), T evenwicht: acht (s).

4) enzymatische reactie en elektrochemische meting

1. Meng door zachtjes te schudden elk Eppendorf-buisje met magnetische korrels klaar voor elektrochemische metingen stap om tot een goed gedispergeerd opschorting van de magnetische beads te verkrijgen;
2. Pipetteer van elk Eppendorf, onmiddellijk na homogenisering, een hoeveelheid van 20 ul van het magnetische kraal dispersie op de overeenkomstige werkende elektrode oppervlak. Voor elke elektrode van een strook gebruik 20 ul van magnetische beads uit verschillende Eppendorf buizen (bijvoorbeeld voor acht elektrode acht verschillende Eppendorf);
3. Voeg 80 ul van enzymatische substraat oplossing op de eerste elektrode. Start 2 min. aftellen. Na 14 seconden, voeg 80 ul van enzymatische substraat oplossing op de tweede elektrode. Na nog eens 14 seconden, voeg 80 ul van enzymatische substraat-oplossing op de derde elektrode. Ga op hetzelfde moment interval (14 seconden) tot de laatste elektrode (dat betekent: druppel elk aliquot van substraat met intervallen van 14 sec). De interval tijd van 14 sec wordt berekend als de tijd die nodig is door de potentiostaat om de meting uit te voeren, van de nota, de 80 ui oplossing op elke sensor moet de werkende, referentie-en contra-elektrode te dekken. Bovendien moeten de oplossingen voor elke sensor niet in contact komen met oplossingen van naburige elektroden.
4. Na de 2 minuten af ​​te tellen vanaf de eerste toevoeging van enzymatische substraat oplossing, start de elektrochemische meting;
5. Gebruik de PalmSens Lite software om de huidige pieken (uA) te verkrijgen voor elke oplossing.

5) Berekening

Stel een ijklijn met behulp van een logistische 4 parameters vergelijking en bereken de concentratie van het totale HT-2/T-2 toxine bedrag in nanogram per milliliter voor elke Eppendorf buis met onbekende monster.

De experimentele gegevens, piekhoogte (uA) tegen de concentratie van de kalibranten (ng / ml), moeten worden uitgerust met een niet-lineaire vier-parameter logistiek (4-PL) vergelijking plot (1) (met behulp van Sigma Plot 8.0 of Kaleidagraph). De niet-lineaire 4-PL-model wordt meestal aangenomen om ligandbinding assays (LBA's) ⁶ beschrijven.

(1)
a, b, x0, y0 zijn logistieke parameters zoals gegeven door de Sigma Plot curve fit programma.
Gebruik de geëxpliciteerd formule om de inhoud van de HT-2/T-2 toxine totale bedrag te berekenen in de verdunde oplossing monsterextract
(2)
x is de massaconcentratie van de totale hoeveelheid HT-2/T-2 toxines in de verdunde extract oplossing, berekend op basis van de logistieke 4 parameters vergelijking in nanogram per milliltre (ng / ml)
y is de huidige waarde in uA verkregen voor het onbekende monster

Appendix

6) gecoate magnetische Beads

Ga als volgt te gecoate magnetische kralen hebben:

Wasprocedure

1. Homogeniseren tosylactivated Dynabeads ® M-280 (voorraadoplossing 2 x 109 kralen / ml) door te schudden en vortexen (max snelheid) gedurende 1 minuut (voorkoming van schuimvorming) (let op de concentratie van de magnetische beads moet altijd hetzelfde zijn om te zorgen voor reproduceerbaarheid in de meting);
2. Onmiddellijk pipet 1 ml van de bovenstaande gehomogeniseerd kralen in een 2 ml Eppendorf buis;
3. Plaats de buis in magnetische deeltjes concentrator met het magnetisch deel op voor de 2 min (zie magnetische korrels plakken op de laterale wand van de buis);
4. Voorzichtig pipet uit de bovendrijvende, waardoor kralen ongestoord;
5. Haal de eppendorfbuisje van de magnetische deeltjes concentrator en resuspendeer de kralen in 1 ml van 0,1 M boraatbuffer pH 9,5. Mix zachtjes gedurende 2 minuten in de roterende steekproef mixer gedurende 2 minuten;
6. Pipet uit de bovendrijvende;
7. Pipetteer 1 ml van boraatbuffer oplossing in het Eppendorf buis. Magnetische kralen zijn nu klaar voor het coaten stap;

Coating procedure

8. Voeg 600 ml van de HT-2-geconjugeerd met KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine) stockoplossing aan 1 ml van de magnetische kralen) (laatste HT-2-KLH concentratie van 375 mg / ml); incubeer magnetische korrels en HT-2-KLH oplossing voor 20u bij 37 ° C * met langzame tilt rotatie op roterende steekproef mixer;
9. Na incubatie plaats de buis in de magnetische deeltjes concentrator en pipet uit de bovendrijvende;
   Was de gecoate parels twee keer met 1 ml PBS / BSA bufferoplossing. Tussen elke wassen te verwijderen PBS / BSA-oplossing. Alle wasstap werden uitgevoerd instelling magnetische korrels en PBS / BSA op de draaiende mixer gedurende 5 minuten;
10. Was magnetische korrels een keer met 1 ml van de TRIS / BSA bufferoplossing. Verwijder de TRIS / BSA-oplossing. Voer deze stap door magnetische korrels en TRIS / BSA buffer op de draaiende mixer gedurende 4 uur bij 37 ° C *;
11. Was magnetische korrels een keer met 1 ml vernieuwd (in de koelkast bewaren bij 4 ° C) PBS / BSA bufferoplossing. Verwijder PBS / BSA-oplossing. Het uitvoeren van deze stap instelling magnetische korrels en PBS / BSA buffer op de draaiende mixer voor 5 min bij kamertemperatuur;
12. Na het wassen stap verwijder alle wasmiddel en voeg 1 ml PBS buffer + NaN ₃ + BSA als opslag vloeistof;
13. Store gecoate magnetische korrels bij 4 ° C (let op dat gecoate magnetische korrels stabiel zijn voor ten minste 2 maanden bij 4 ° C);

* Voor dit doel de mixer wordt geplaatst in de oven is uitgerust met een gat dat het inbrengen van de kabel voor de voeding mogelijk maakt. Als alternatief kan de mixer kon worden geplaatst in een thermostatisch kamer bij 37 ° C.

7) Voorbereiding van het monster en extractie

25 g fijn gemalen monster (babyvoeding of ontbijtgranen) zijn wijighed in een blender pot en geëxtraheerd met 100 ml acetonitril / water-oplossing (86/14) voor 3 min in een high-speed blender. Na het centrifugeren bij 4000 rpm (3000 g) voor 5 min, 8 ml van de bovenstaande werden genomen en gezuiverd met Mycosep kolom, werden 4 ml van de gereinigde extract gedroogd onder stikstofstroom. Gedroogde monsters kan worden opgeslagen bij -30 ° C tot enkele maanden.

8) Voorbeeld reconstitutie

Ontbijtgranen

Los het droge ontbijtgranen extract (op basis van granen voeding bestemd voor volwassen consumptie) met 40 ml PBS pH 7,4. Op deze manier wordt een monster met een concentratie van toxine die gelijk is aan de veronderstelde wettelijke limiet (200 ng / g) geeft in de meting stap een signaal vallen in het midden van het werkgebied.

Babyvoedsel

Reconstitueer de gedroogde babyvoeding extract (op basis van granen voedsel bestemd voor babyvoeding) met 4 ml PBS. Op deze manier wordt een monster met een concentratie van giftige stoffen die gelijk is aan de veronderstelde wettelijke limiet (20-25 ng / g) geeft in de meting stap een signaal vallen in het midden van het werkgebied.

Discussion

Het gebruik van antilichamen als biomoleculaire erkenning probe heeft gezien een wijdverbreide gebruik voor het waarnemen van technologieën; immunochemische detectie methoden, zoals ELISA's en MEIAs, zijn tegenwoordig een van de meest gebruikte platforms en toegepast in veel laboratoria ^7.

Hoewel deze benaderingen uitzonderlijke gevoeligheid en specificiteit, een primaire doelstelling van vele onderzoeksgroepen te bereiken in de afgelopen jaren is het verbeteren en optimaliseren van hun prestaties.

In dit protocol hebben we laten zien hoe te fabriceren en te ondervragen een elektrochemische immunosensor voor mycotoxine detectie. Wij geloven dat het gebruik van de elektrochemie aan immuno-gebaseerde sensoren te ontwikkelen zal blijken te zijn van toenemend belang in de toekomst. Dit is te wijten aan de inherente voordelen van elektrochemische detectie over de optische een. Elektrochemie is in feite minder gevoelig voor storingen en heeft bewezen opvallend robuust is voor de niet-specifieke adsorptie en goed presteren, zelfs wanneer uitgedaagd in complexe matrices monster, zoals ontbijtgranen en babyvoeding. Bovendien, elektrochemie is meer geschikt voor miniaturisatie en om multi-array aanpassing.

De koppeling van een dergelijke aanpak met magnetische nanodeeltjes zijn ook een verbetering van de analytische prestaties en hebben bewezen bijzonder geschikt te zijn voor verontreinigingen detecteren in voedsel monsters.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P9791
Disodium hydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
MgCl2 anhydrous	Sigma-Aldrich	M8266
DEA (99.5%)	Sigma-Aldrich	31589
HCl 37%	Sigma-Aldrich	320331
H3BO3	Sigma-Aldrich	B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane	Sigma-Aldrich	252859
BSA (albumin bovine serum)	Sigma-Aldrich	A4503
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
NaN3	Aldrich	71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt	Fluka	N7255
Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS):	Biopure	004050	The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2 toxin	Biopure
Magnetic beads: Dynabeads®	Invitrogen	M-280 Tosylactivated	Concentration 2 x 109 beads/ml.
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4			Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8			Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5			Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5			Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05%			Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1%			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02%			Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution
Enzymatic substrate			Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution			Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution			Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution			Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions			Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH			Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody			Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody			Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S	Invitrogen
PalmSens instrument	PalmSens		Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Eight channel Mux electric contact			hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs)			hand made
Specially designed support for electrodes strip			hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes	Gilson, Inc.
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes.	Eppendorf
Falcon tubes of 5ml and 15ml.	Falcon BD
Laboratory Vortex Mixer			Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room			Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.