Summary
Abstract
Гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) являются редкой популяции плюрипотентных клеток, которые поддерживают все дифференцированных линий крови на протяжении всей жизни организма. Функциональное определение HSC является пересаженные ячейки, имеет возможность восстановить всю кровь происхождений облученных получателя долгосрочной перспективе. Это назначение было установлено десятилетий плодотворной работы в млекопитающих. Использование трансплантации гемопоэтических (HCT) и обратного генетических манипуляций в мышь, основные регуляторные факторы ГСК биологии начала будет открыт, но все еще в значительной степени под-изучены. В последнее время данио стала мощная генетическая модель для изучения позвоночных кроветворения. Создание HCT в данио позволит ученым использовать крупномасштабные генетического и химического скрининга методологий в данио выявить новые механизмы, лежащие HSC регулирования. В этой статье мы продемонстрируем метод для выполнения HCT во взрослых рыбок данио. Мы показываем, вскрытие и подготовка данио весь мозг почки, сайт взрослых гемопоэз у данио рерио, и введение этих донорских клеток в кровоток облученного рыбы получателя через внутрисердечной инъекции. Кроме того, мы расскажем после трансплантации уход рыбы в "реанимации", чтобы увеличить их здоровье в долгосрочной перспективе. В общем, нежная забота о рыбе до, во время и после пересадки имеет решающее значение для увеличения количества рыбы, которая переживет не один месяц в соответствии с процедурой, которая необходима для оценки долгосрочной перспективе (<3 месяца) приживления. Экспериментальные данные используются для установления этого протокола будет опубликовано в другом месте. Создание этого протокола позволит слияния крупных генетики данио и трансплантации биологии.
Protocol
Облучение
- Радиация WT рыбу 25Gy за 2 дня до пересадки
Почки рассечение
- Жертва соответствующего количества флуоресцентного доноров в tricaine (~ 100 мл 4mg/ml Tricaine / литр рыба) (в среднем 500 000 клеток на донора рыба)
- Изолировать почек в 0,9 x PBS + 5% FCS + 1% Пенн стрептококк ("PBS +") в трубку
- Перерыв с 1 мл пипетки, затем с 10 мл шприц с 18 1 / 2 иглы G
- Перевод на 50 мл конические и пополнить с PBS +
- Спином вниз @ 1500rpm 8 минут
- Вылейте, ресуспендируют гранулы в большом объеме и фильтруют через фильтр 40micron
- Спином вниз @ 1500rpm 8 минут
- Вылейте, ресуспендируют в 1 мл PBS +, трансфер в Эппендорф трубки
- Для фото: 10ul клетка соль + 90ul трипанового синего (теперь его разбавляют в 10 раз)
- 10ul клетка соль + 90ul PBS + (теперь его разбавляют в 10 раз)
- Дайте постоять 5 минут, добавить соль 10ul как по обе стороны от hemacytometer
- Граф клеток в большую коробку (5x5), счета за смерть процент, если значительная
- Клеток / мл = (клеток) (10 4) (x10 дил. Фактор)
Пример - 60 клеток рассчитывали на hemacytometer является 6000000 клетки общего - Спином вниз образца @ 1500rpm 8 минут
- Рассчитать объем для ресуспендирования гранул, чтобы получить соответствующие концентрации клеток
- 5ul общем объеме внедрить - 3ul время ВКМ и 2UL будучи периферической крови
- Пример - есть 6000000 клетки общего
хотите, чтобы пересадить 200000 клеток на получателя
есть 20 получателям
хотят 66667 клеток / UL (200000 клеток / 3ul)
ресуспендируют осадок в 90ul (6000000 кл / 66667 клеток / мкл)
нужно всего лишь о 60ul этого (20recip х 3ul)
Периферийные добычи крови
- Жертва соответствующее количество WT рыбы в tricaine (~ 100 мл 4mg/ml Tricaine / литр рыба) для носителя крови (в среднем 2 миллиона клеток на донора)
- Антикоагулянтная: разбавьте 1UL (3unit/ul) в 1 мл PBS +
- Пальто пипетки наконечник с гепарином, удар через жаберные с пипетки отзыв, добавить крови PBS +
- Спиновые 1500rpm 5мин, ресуспендируют в 1,5 мл
- Спиновые 1500rpm 5мин, ресуспендируют в 1 мл
- Фильтра через фильтр 40micron
- Граф клетки, что и выше
- Клеток / мл = (клеток) (10 4) (x10 дил. Фактор)
- Счет за смерть
- Рассчитать ресуспендирования объем, что и выше
Инъекция
- Inject 5ul в сердце каждого получателя помощи шприца Гамильтона
- Обезболить рыбы в tricaine (4.2ml (4mg/ml) Tricaine / 100 мл воды рыба) и положите на влажную губку
- Вставьте кончик немного позади сердца
- Пока вокруг области сердца, пока не увидите небольшой взрыв крови (то есть вы попали в сердце) -> не могли бы видеть это, но вводить в любом случае
Рыба ICU - после инъекции
- Хранить рыбу с потоком в течение 1 недели, чтобы избежать инфекции
- Положите 5-10 рыбы в клетке
- Удалить мертвых и вести учет
- Вручную менять воду каждый день
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
