Summary
Abstract
造血干细胞（HSC）是一种罕见的多能干细胞，维持一个有机体的整个生命的所有区别的血谱系人口。 HSC的功能定义是移植的细胞，有能力重建所有的血液辐照收件人长期谱系。这指定成立几十年来在哺乳动物系统的开创性工作。利用造血干细胞移植（HCT）和反向基因操作在小鼠，HSC的生物学的基本调控因子也开始亮相，但在很大程度上仍是探索。近日，斑马鱼已成为一个强大的遗传模型来研究脊椎动物的造血功能。建立在斑马鱼的小贩管理队，将允许科学家利用大型的遗传和化学的筛查方法，在斑马鱼揭示底层HSC的调节的新机制。在这篇文章中，我们展示了一个方法来执行在成年斑马鱼的小贩管理队。我们表明斑马鱼的整个肾骨髓的清扫和准备，在斑马鱼的成人造血网站，这些体细胞通过腔内注射照射收件人鱼流通。此外，我们描述了在一个“加护病房”鱼移植后的护理，以增加他们的长期健康。一般情况下，温柔的呵护鱼之前，期间和之后，移植是关键，以增加鱼的数量将存活超过1个月以下的程序，这是必要的评估（<3个月）长期植入。将别处发表的实验数据，用于建立本议定书。建立这个协议将允许的大规模的斑马鱼遗传学和移植生物学合并。
Protocol
放射
- 照射25Gy移植前2天的WT鱼
肾夹层
- 牺牲tricaine（〜100ml 4mg/ml Tricaine中/升鱼水）（平均每50万捐助鱼类细胞）的适当数量的荧光捐助者
- 隔离到0.9倍PBS + 5％FCS + 1％宾夕法尼亚链球菌（“PBS +”）在管的肾
- 分手用1ml吸管，然后用10ml注射器18 1 / 2 G针
- 转移到50毫升锥形，并填写用PBS +
- 离心1500RPM 8分钟时
- 倒出来，重新悬浮颗粒40micron过滤器的过滤器，并通过大量
- 离心1500RPM 8分钟时
- 倒出来，悬浮在1毫升PBS +，转移到Eppendorf管
- 数：10ul细胞溶胶+ 90ul台盼蓝（现在是稀释10倍）
- 10ul细胞溶胶+ 90ul PBS +（现在是稀释10倍）
- 静置5分钟，加入10ul都溶胶的hemacytometer两侧
- 如果显着，在大箱（5X5），帐户计数细胞死亡百分比
- 细胞/ ml =（细胞计数）（10 4）（X10 DIL因子）
范例 - 60细胞hemacytometer计算共600万细胞 - 离心样品@ 1500RPM 8分钟
- 计算体积重悬浮颗粒在得到适当浓度的细胞
- 5ul总量注入 - 3ul WKM和2ul外周血
- 范例 - 有600万细胞总数
要20万个受体细胞移植
有20个收件人
希望66667细胞/ UL（200,000细胞/ 3ul）
重新悬浮颗粒（600万细胞/ 66667细胞/ UL）在90ul
只需要大约60ul，（20recip x 3ul）
外周血提取
- 牺牲载体血（平均200万，每供体细胞）适当的WT鱼的数量在tricaine（〜100ml 4mg/ml Tricaine中/升鱼水）
- 抗凝血剂：稀1ul在1ML PBS（3unit/ul）+
- 大衣与肝素吸管尖，通过吸管尖的刺刺伤，加血，以PBS +
- 自旋1500RPM 5min后，在1.5ml的悬浮
- 自旋1500RPM 5min后，在1毫升悬浮
- 过滤过滤器通过40micron
- 计数上述细胞
- 细胞/ ml =（细胞计数）（10 4）（X10 DIL因子）
- 死亡的帐户
- 上述计算再悬浮量
注塑
- 注入到每个收件人使用的是汉密尔顿注射器的心5ul
- 麻醉对湿海绵鱼在tricaine（4.2毫升（4mg/ml）鱼水Tricaine元/ 100ml）和地点
- 插入提示一点背后的心
- 围绕心脏部位捅，直到你看到一个小血爆裂（这意味着你打心） - >可能看不到这一点，但注入反正
鱼加护病房 - 注射后
- 保持1周关闭流鱼，以避免感染
- 每笼放入5-10鱼
- 去除死皮，并保持记录
- 手动改水每一天
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