Biology

Transplantatie van Whole nier Marrow in Adult zebravis

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/159

Jocelyn LeBlanc¹, Teresa Venezia Bowman¹, Leonard Zon¹

¹Children's Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

Abstract

Hematopoietische stamcellen (HSC) zijn een zeldzame populatie van pluripotente cellen die al het bloed gedifferentieerde lijnen gedurende de gehele levensduur van een organisme te handhaven. De functionele definitie van een HSC is een getransplanteerd cel die het vermogen om te herstellen al het bloed lineages van een bestraald ontvanger op lange termijn heeft. Deze benaming is opgericht door tientallen jaren van baanbrekende werk in zoogdieren systemen. Met behulp van hematopoietische stamceltransplantatie (HCT) en omgekeerde genetische manipulaties in de muis, zijn de onderliggende regelgeving factoren van HSC biologie begint te worden onthuld, maar zijn nog steeds grotendeels onder-onderzocht. Onlangs heeft de zebravis ontpopt als een krachtig genetisch model om gewervelde hematopoiesis studeren. Tot vaststelling van HCT in de zebravis zal kunnen wetenschappers de grootschalige genetische en chemische screening methodologieën beschikbaar in zebravis om nieuwe mechanismen die ten grondslag liggen aan HSC regelgeving onthullen gebruiken. In dit artikel tonen we een methode om HCT uit te voeren bij volwassen zebravissen. We tonen de dissectie en voorbereiding van de zebravis hele nier merg, de site van de volwassen hematopoiese in de zebravis en de introductie van deze donor cellen in de circulatie van bestraalde ontvanger vis via intracardiale injectie. Daarnaast beschrijven we de post-transplantatie zorg van de vis in een "ICU" om hun gezondheid op lange termijn te verhogen. In het algemeen, zachte verzorging van de vissen voor, tijdens en na de transplantatie is cruciaal voor het aantal vissen dat meer dan een maand na de procedure, die essentieel is voor de beoordeling van de lange termijn (<3 maanden), innesteling zal overleven toenemen. De experimentele gegevens die worden gebruikt om dit protocol te stellen, zal elders worden gepubliceerd. De oprichting van dit protocol zal zorgen voor de fusie van grootschalige zebravis genetica en biologie transplantatie.

Protocol

Bestraling

Bestralen WT vis op 25Gy 2 dagen voor de transplantatie

Nier dissectie

Offer gewenste aantal TL-donoren in tricaïne (~ 100 ml 4mg/ml tricaïne / liter water van de vis) (gemiddelde van 500.000 cellen per donor vis)
Isoleer nier in 0.9x PBS + 5% FCS + 1% Penn STREP ("PBS +") in tube
Breuk met 1 ml pipet, daarna met 10 ml spuit met 18 1 / 2 G naald
Overdracht naar 50ml conische en vul met PBS +
Spin down @ 1500 rpm 8min
Uitgieten, hersuspenderen pellet in groot volume en filtreer door 40micron filter
Spin down @ 1500 rpm 8min
Uitgieten, opnieuw in suspensie in 1 ml PBS +, transfer naar eppendorfbuisje
Te tellen: 10ul cel sol + 90ul trypan blauw (nu is het verwaterd 10X)
10ul cel sol + 90ul PBS + (nu is het verwaterd 10X)
Laat staan 5 min, voeg 10ul zowel sol aan weerszijden van hemacytometer
Tellen cellen in grote doos (5x5), verantwoordelijk voor de dood percentage als significant
Cellen / ml = (celgetal) (10 ⁴⁾ (x10 dil. Factor)

Voorbeeld - 60 cellen geteld op hemacytometer is 6.000.000 cellen in totaal
Spin down monster @ 1500 rpm 8min
Bereken het volume aan hersuspenderen pellet in de juiste concentratie van de cellen te krijgen
5ul totale volume te injecteren - 3ul wordt WKM en 2ul wordt perifere bloed
Voorbeeld - zijn 6.000.000 cellen in totaal

wil 200.000 cellen per ontvanger transplantatie

hebben 20 ontvangers

wil 66.667 cellen / ul (200.000 cellen / 3ul)

hersuspenderen pellet in 90ul (6.000.000 cellen / 66.667 cellen / ul)

hoeft alleen maar over 60ul van die (20recip x 3ul)

Perifere bloed extractie

Offer gewenste aantal WT vissen in tricaïne (~ 100 ml 4mg/ml tricaïne / liter water van de vis) voor de carrier bloed (gemiddeld 2 miljoen cellen per donor)
Anticoagulantia: verdunnen 1ul (3unit/ul) in 1 ml PBS +
Coat pipet tip met heparine, steek door middel van kieuwen met pipet tip, extra bloed aan PBS +
Spin 1500 tpm 5min, opnieuw in suspensie in 1,5 ml
Spin 1500 tpm 5min, opnieuw in suspensie in 1 ml
Filteren door middel van 40micron filter
Tellen cellen zoals hierboven
Cellen / ml = (celgetal) (10 ⁴⁾ (x10 dil. Factor)
Rekening voor de dood
Bereken resuspensie volume, zoals hierboven

Injectie

Injecteer 5ul in het hart van iedere ontvanger met behulp van een injectiespuit Hamilton
Verdoven vis in tricaïne (4.2ml (4mg/ml) tricaïne / 100ml vissen water) en leg ze op een vochtige spons
Plaats tip een beetje achter hart
Poke rond het hart gebied tot je een kleine uitbarsting van het bloed (wat betekent dat je raakt het hart) -> Zou dit niet ziet, maar toch injecteren

Vis ICU - post-injectie