El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Summary

Abstract

Las células madre hematopoyéticas (HSC) es una rara población de células pluripotentes que mantienen todos los linajes de sangre diferenciados a lo largo de la vida de un organismo. La definición funcional de un HSC es una célula trasplantada que tiene la capacidad de reconstituir todos los linajes de sangre de un receptor a largo plazo irradiados. Esta designación fue establecido por décadas de trabajo pionero en sistemas de mamíferos. Al usar el trasplante de células hematopoyéticas (HCT) y revertir la manipulación genética en ratones, los factores reguladores de la biología HSC están empezando a ser desvelado, pero siguen siendo en gran parte bajo explorado. Recientemente, el pez cebra se ha convertido en un poderoso modelo genético para estudiar la hematopoyesis vertebrados. El establecimiento de HCT en el pez cebra permitirá a los científicos utilizar las metodologías de detección a gran escala genéticos y químicos disponibles en el pez cebra para revelar nuevos mecanismos subyacentes regulación de HSC. En este artículo se demuestra un método para llevar a cabo HCT en el pez cebra adulto. Se muestra la disección y preparación de la médula del pez cebra riñón entero, el sitio de la hematopoyesis de adultos en el pez cebra, y la introducción de estas células del donante en la circulación de los peces receptores irradiados a través de la inyección intracardíaca. Además, se describen los cuidados post-trasplante de peces en una "unidad de cuidados intensivos" para aumentar su salud a largo plazo. En general la atención y suave de los peces antes, durante y después del trasplante es fundamental para aumentar el número de peces que sobreviven más de un mes después del procedimiento, que es esencial para la evaluación de largo plazo (<3 meses) el injerto. Los datos experimentales utilizados para establecer este protocolo será publicado en otra parte. El establecimiento de este protocolo permitirá la fusión de gran escala genética del pez cebra y la biología del trasplante.

Protocol

Irradiación

1. Irradiar a los peces PESO 25Gy dos días antes del trasplante

La disección del riñón

1. Sacrificio de un número adecuado de donantes fluorescentes en tricaína (~ 100 ml 4mg/ml tricaína / litro de agua de pescado) (promedio de 500.000 células por los peces de los donantes)
2. Aislar a los riñones en 0.9x PBS + 5% + 1% FCS Penn por estreptococo ("PBS +") en el tubo
3. Romper con pipeta de 1 ml, y luego con jeringa de 10 ml con 18 1 / 2 agujas G
4. Transferencia a 50 ml cónicos y se llenan de PBS +
5. Centrifugar a 1500 rpm 8 minutos
6. Derrama, resuspender el pellet en gran volumen y filtrar a través del filtro 40micron
7. Centrifugar a 1500 rpm 8 minutos
8. Derrama, resuspender en 1 ml de PBS +, traslado al tubo eppendorf
9. Contar: 10 ul de células sol + 90ul azul tripán (ahora se diluye 10 veces)
10. 10 ul de células sol + 90ul PBS + (ahora se diluye 10 veces)
11. Deje reposar 5 minutos, añadir 10 ul tanto sol a ambos lados del hemocitómetro
12. Recuento de células en la caja grande (5x5), cuenta para el porcentaje de muerte si es significativo
13. Células / ml = (recuento de células) (10 ⁴⁾ (x10 dil. Factor)
    
    Ejemplo - 60 células contadas en hemocitómetro es 6.000.000 el total de células
    
    
14. Centrifugar la muestra a 1500 rpm 8 minutos
15. Calcular el volumen para volver a suspender el pellet en conseguir la concentración adecuada de las células
16. El volumen total de 5UL para inyectar - WKM 3UL ser y 2UL sangre periférica se
17. Ejemplo - 6.000.000 el total de células
    
    quiere trasplantar células 200.000 por beneficiario
    
    con 20 beneficiarios
    
    quieren 66.667 células / ul (200.000 células / 3UL)
    
    resuspender el pellet en 90ul (6,000,000 células / 66.667 células / ul)
    
    sólo necesita alrededor de 60ul de que (x 20recip 3UL)

Extracción de sangre periférica

1. Sacrificio de un número adecuado de peces WT en tricaína (~ 100 ml 4mg/ml tricaína / litro de agua de pescado) para que la sangre portadora (una media de 2.000.000 células por los donantes)
2. Anticoagulante: 1 ul diluida (3unit/ul) en 1 ml de PBS +
3. Punta de pipeta con capa de heparina, apuñalar a través de branquias con punta de la pipeta, añadir a la sangre PBS +
4. Giro 1500 rpm 5 minutos, volver a suspender en 1,5 ml
5. Giro 1500 rpm 5 minutos, resuspender en 1 ml
6. Filtro a través del filtro de 40micron
7. Recuento de células que el anterior
8. Células / ml = (recuento de células) (10 ⁴⁾ (x10 dil. Factor)
9. Cuenta de la muerte
10. Calcular el volumen de resuspensión de arriba

Inyección

1. Se inyecta en el corazón de 5UL de cada destinatario mediante una jeringa Hamilton
2. Anestesiar a los peces en tricaína (4.2ml (4mg/ml) tricaína / 100 ml de peces de agua) y colocar en una esponja húmeda
3. Inserte la punta un poco por detrás del corazón
4. Hurgar área del corazón hasta que aparezca una pequeña cantidad de sangre (lo que significa que golpeó el corazón) -> no puede ver esto, pero de todos modos se inyectan

UCI pescado - después de la inyección

1. Mantener el flujo de los peces durante 1 semana para evitar la infección
2. Coloque el pescado 05.10 por jaula
3. Eliminar muertos y llevar un registro
4. Manualmente los cambios de agua cada día