Summary
우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.
Abstract
hydrogels 내에서 세포의 3D 캡슐은 culturing 세포 및 조직 공학을위한 구조의 개발을 향해 점점 더 중요하고 인기있는 기술을 나타냅니다. 이 환경은 더 인해 조직과 같은 속성과 3D 환경, 표준 조직 문화에 비해 세포가 생체내에서 관찰 무엇 모방한 것이었 지요. 합성 고분자 hydrogels은 안정이나 새로운 조직이 캡슐 세포에 의해 입금 그대로 가수 분해 또는 proteolysis를 통해 저하될 수 있도록 설계 수있는 물을 부었 네트워크입니다. 고분자의 다양한는 같은 폴리 (에틸렌 글리콜)과 hyaluronic 산성 이러한 응용 프로그램에 대해 살펴왔다. 가장 일반적으로, 고분자는 이러한 methacrylates 또는 다양한 메커니즘을 통해 crosslinking를 겪고 수 acrylates 같은 반응 그룹으로 작용합니다. 캡슐 줄기 세포 (. 버딕 외)의 분화를 포함하여 생존과 직접적인 세포 표현형을 개선하기 위해 - 생화 학적 신호의 물리적 또는 펜던트 공유 결합 정관을 통해, 예를 들어 - 지난 10 년간 많은 진전이 엔지니어링이 microenvironments을 이루어왔다.
세포의 3D 캡슐에 대한 다음과 같은 방법 cytocompatibility을 극대화하고 히드로겔 처리 단계의 수를 최소화하기 위해 다른 실험실에서 최적화되었습니다. 다음과 같은 프로토콜 (절차의 그림에 대한 그림 1 참조), 그것은 crosslinking를 겪고 수 기능화 고분자가 손에 이미 것으로 간주됩니다, 같은 조직 공학 분야에 적용 고분자 화학 우수 리뷰는 다른 찾을 수 있습니다 (버딕 외.) 이러한 방법은 폴리머 타입의 범위와 호환됩니다. 또한, 마이클 타입 추가 (Lutolf 외를 참조하십시오.)와 자유 라디칼 (Elisseeff 외를 참조하십시오.) 메커니즘 여기에 초점을 맞춘 가벼운 시작은 보고된 crosslinking 기술의 단지 작은 부분을 구성합니다. 반응 그룹의 일부가 처음 추가 crosslinking에 의해 소비하고 근본적인 메커니즘 뒤에있는 혼합 모드 crosslinking은 캡슐화된 세포 (Khetan 외., 살리 나스 외.)의 표현형를 지시하고 또 다른 일반적으로 사용하고 강력한 패러다임이다.
Protocol
A. 재료 준비 및 살균
- 사전 준비 캡슐화 재료에 혼합하고 37 ° C. 며칠에 대한 잠복기에 의해, (PBS) 호수 버퍼 인산의 photoinitiator Irgacure 2959 (I2959)의 0.5 % WT의 솔루션을 준비 이 솔루션은 다음 주사기 살균에 대한 필터링 및 장기 사용을 위해 상온에서 저장할 수 있습니다.
- 합성 수 젤의 원하는 구성에 따라, 폴리머 및 crosslinker의 무게가 필요 (예 : Microsoft Excel과 같은 스프레드 시트 프로그램을 사용하여) 계산합니다. 폴리머 주어진 무게가 hydrogels, crosslinker 및 전체 젤 볼륨의 폴리머 솔루션 부분에서 원하는 농도를 달성하기위한 정의된 총 볼륨에서 용해해야하기 때문에 또한 스프레드 시트를 사용하여 결정되어야합니다. 모든 펜던트 moieties (예, 접착제 RGD 또는 oligopeptide를 포함 YGSR) 이전 crosslinking에 통합하는 경우에는 비슷한 계산을하여야한다.
- Eppendorf 튜브에 필요한 폴리머와 crosslinker의 금액과 장소의 무게를. 얻은 고분자의 실제 중량에 대해 적절하게 계산 스프레드 시트를 조정합니다. (참고 : 볼륨 얻은 폴리머와 crosslinker의 실제 대량 보상을 변경할 수 있습니다.)
- 개별적으로 포장 무균 1 ML 일회용 주사기의 정상을 차단하기 위해 면도날을 사용하여 겔 금형을 준비합니다. 확인 평면 절단은 photopatterned의 젤을 위해 사용되는 금형에 대해 이루어집니다.
- 주사기 금형, Eppendorf 튜브 (뚜껑 열고) 및 살균 광원 (일반적으로 생물 안전 캐비닛에 내장) 아래에 다른 필요한 자료를 놓고 30 분 소독.
B. 셀 준비
- 살균에 따라 적절한 멸균 버퍼 볼륨을 추가합니다 (스프레드 시트 계산 당, 버퍼의 선택은 달라질 수 PBS와 같은 triethanolamine 같은 약한베이스 버퍼는 일반적으로 자유 라디칼과 마이클 타입 crosslinking, 각각을 위해 사용되는 수있는 동안) 폴리머 Eppendorf 및 (옵션) 펜던트 잔기 포함하는 (예를 들어, 접착제 펩타이드)와 디졸브로 와동 (멸균 후드 랩 외부 parafilm으로 Eppendorf을 vortexing 경우).
- 폴리머 솔루션에 펜던트 잔기 솔루션의 적절한 볼륨을 추가하고 parafilm과 인감을 바꿈. 셀 준비 중에 ° C가 반응 37 간략 와동과 부화 (가능한 경우, 로타리 저어 접시 위에). 펩타이드가 최종 히드로겔의 펜던트 그룹으로 포함되도록 이것은 아크릴 레이트 또는 메타 크릴 레이트에 대한 펩타이드에 thiol의 반응 (시스테인 그룹을 통해)이 포함됩니다.
- Trypsinize 및 세포 및 젤류의 각 집합에 해당하는 숫자를 포함하는 부분에 별도의 계산. 예를 들어, 10000000 세포 / 개인 원뿔 관에 ML, 별도 1500000 세포의 밀도가 세 50 μL 젤의 집합에 대한. 그것은 더 이상 4보다 젤가 겔화의 타이밍 (젤 여러 세트를 합성하는 경우, 모든 집합에 대한 폴리머 솔루션의 적절한 볼륨을 포함하는 단일 Eppendorf 준비를 사용할 수 있습니다)으로 인해 개별 세트로 준비하는 것이 좋습니다.
- 세포를 원심 분리기.
- 세포가 다운 방적 있지만
- 라이트는 자유 라디칼 crosslinking를 시작 : 전체 젤 세트 볼륨의 10 % (0.05 WT %의 최종 개시제 농도)로 동등한 폴리머 솔루션에 0.5 WT % I2959 솔루션을 추가합니다.
- 마이클 타입 (덧셈) crosslinking : 적절한 농도 솔루션을 달성하기 crosslinker에 버퍼를 추가합니다.
- 연속 crosslinking 들면 :이 젤은 crosslinking 두 종류를 통합하고 이전 단계를 모두 필요로합니다.
C.의 히드로겔 형성
- centrifuged 셀 부분에서 뜨는을 대기음. 세포 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 많은 매체를 제거하는 초기 열망하고 다시 대기음 후 정착에 액체 기다립니다.
- 세포가 균일하게 분포돼 때까지 폴리머 솔루션 세포 펠렛을 Resuspend. 천천히 솔루션을 pipetting하여 기포 형성을 최소화하고 아래로 (약 10 사이클 세포를 배포하기에 충분해야합니다.)
- Crosslinking의 Hydrogels
- 나누어지는 주사기 팁 금형에 적절한 볼륨 : 라이트는 자유 라디칼 crosslinking을 시작. 근본 crosslinking에 대한 자외선에 주사기를 노출 (예 : 365 NM에 10 분 노출, 4 mW/cm2 UV 라이트는 아크릴 레이트 기능화 폴리머에 대한 일반적입니다.) 이 단계는 세포 자외선 노출 전에 정착 최소화하기 위해 신속하게 수행하여야한다.
- 마이클 타입 (덧셈) crosslinking : 다양한 오리피스 피펫 팁을 사용하면, 고분자 / 세포 솔루션 crosslinker 솔루션의 적절한 볼륨을 추가 원하는 개별 겔 볼륨에 피펫을 설정, 솔루션을 피펫 아래로균질 및 주사기 팁 금형으로 나누어지는. 이 단계는 세포의 균등을 보장하기 위해 신속하게 수행하여야한다. crosslinking에 대한 문화 모자 10~30분이 (개별 시스템에 따라) 인큐베이션 수 있습니다.
- 연속 crosslinking : 이것은 다음 마이클 타입 이외의 첫번째 반응은 두 번째 crosslinking에 대한 조명에 노출을 포함한다. 이론 crosslinks의 일부 분일 뿐인 걸까은 첫 번째 crosslinking 동안 반응해야하고 살균 마스크 전에 소독 핀셋을 사용하여 빛을 노출로 겔 표면에 직접 적용해야합니다. 그것이 젤 크게 가교 지역에서 우선적으로 통합할 수 있기 때문에 기능화 염색 (20 NM의 겔에서 최종 농도에서 예, methacrylated rhodamine (MeRho)가)도 (그림 2, patterning을 시각화하는 초기 솔루션에 추가할 수 있습니다 ).
D. 셀 문화 및 분석
- 다음 crosslinking, 부화 및 분석을위한 매체를 포함하는 조직 문화 판의 우물 (다음 단계 참조)에 플런지 젤.
- 형광 죽은 / 라이브 얼룩 키트를 (그림 3, 4)를 사용하고 생존 능력, 세포는 형태로 가벼운 현미경 (일반적으로, 합성 hydrogels은 투명 그림 3)를 사용하는 시각 수 있습니다. (예, 4' - 6 - Diamidino - 2 - phenylindole (DAPI)) 세포 굴지 (예 : rhodamine 또는 플루오레신가 phalloidin로 표시)과 핵에 대한 얼룩 것은 다음과 같은 절차를 표준으로 고정하고 permeabilization 절차를 (그림 4)를 사용하여 수행할 수 있습니다.
- PBS로 5 분 배 구조를 씻어.
- 실온에서 30 분 1 ML 4 % 포름 알데히드에 부화하여 젤을 수정.
- 3퍼센트 (W / V) BSA와 0.5 % (W / V) PBS에서 트윈을 포함 차단 솔루션 배 구조를 씻어.
- 0.25 % (W / V) 20 분 솔루션을 차단에서 트리톤 X와 함께 막을 Permeabilize.
- 솔루션을 차단과 배 구조를 씻어.
- 0.66 μg / 상온에서 두 시간 동안 솔루션을 차단에 ML FITC 또는 rhodamine phalloidin과 함께 F - 굴지에 대한 얼룩.
- 솔루션을 차단과 배 린스.
- 20 분 0.4 μL / PBS에 ML DAPI를 사용하여 세포 핵을 얼룩.
- PBS로 3 배 린스.
- epifluorescent 또는 공촛점 현미경을 사용하여 세포를 시각화.
- 젤 내의 세포의 확산은 일반적으로 시판 assays (예, 전체 DNA 또는 생화학 콘텐츠)를 사용하여 평가됩니다. PicoGreen 더블 - 좌초된 DNA quantifying에 대한 얼룩 일반적으로 사용하고 민감한 형광 핵산이다 (싱어 외 있습니다.). 세포도 계산하고 2 단계에 설명되어있는 시각화 방법을 사용하여 초기 제어 번호 정상화 수 있습니다.
- Histological sectioning와 얼룩은 또한 세포를 시각화하고 매트릭스를 형성하는 데 사용할 수 있습니다. 3D hydrogels의 탈수 및 sectioning에 대한 다음과 같은 프로토콜은 유리 슬라이드에 횡단면 조각을 얻을하는 데 사용할 수 있습니다 :
- 고정 및 탈수
- PBS로 3 배 표본 린스.
- 4 % paraformaldehyde 30 분 - 5 수정.
- PBS로 3 배 표본 린스.
- 25 EtOH에서 샘플을 품어 ° C 다음 EtOH (V / V) 물 농도 (순서대로) 각각 1 시간 동안 : 50 % 70 % 95 %, 95 %, 100 % (이 시점에서, 표본 25 밤새 저장할 수 있습니다 ° C).
- 클리어링와 침투
- 25 1 시간 ° C, 65 한 시간 뒤에 ° C. 100 % Citrisolv로 전송
- 샘플의 단면이 노출되는 등 페트리 접시에 면도날로 절반 샘플 컷.
- 65 1 시간에 대한 Citrisolv / 마이크로 컷 파라핀의 혼합물로 전송 1시 1분 ° C.
- 65 1 시간 100 % 마이크로 컷 파라핀으로 전송 ° C.
- 65 밤새 백퍼센트 마이크로 컷 파라핀으로 전송 ° C.
- 65 1-2시간 100 % 마이크로 컷 파라핀으로 전송 ° C.
- 퍼가기
- 100 % 파라핀과 껍질 - 거리 금형의 위치 표본.
- 금형 침대에서 왁스의 작은 금액을 놓고, 단면이 아래로 향하게있는 샘플의 두 반쪽을 삽입합니다.
- 상단 필터 조각을 적용
- 잠수함 상단 부분을 추가 왁스를 추가하고 ~ 10 분 동안 경화 수 있습니다.
- ° C의 냉장고가 강화하기 위해 표본은 하룻밤 수 있도록 4 삽입을 전송.
- 스피스먼 섹션 수 있습니다에드 다음날은 일반적으로 슬라이스 당 50-10 μm의 두께에 상용 microtomes를 사용합니다. 일반적으로 껍질 - 거리 금형은 마이크로톰 단계에 대해 수직으로 장착되며, 수동 제어는 칼날과 샘플의 섹션 두께, 슬라 이서 및 정렬을 설정하는 데 사용됩니다.
- RNA 추출
유전자 발현도 (예, 실시간 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)을 통해) 양적 평가 수 있습니다. 3 차원 hydrogels에서 RNA 추출, 아래는 그 중 예를 들면,에 대한 프로토콜은 훨씬 간단 2D 사건에서 상당히 다릅니다.- 각 3D 히드로겔에 대한 인증 RNAse 무료 Eppendorf 튜브에 레이블을 각 튜브 500 μL Trizol ® 시약을 추가합니다.
- 명확한 솔루션 얻을 때까지 수동으로 hydrogels을 부러 유봉 (조직 분쇄기)를 사용합니다. 확인 다른 그라인더는 각 조건에 사용됩니다.
- 와동 각 Eppendorf 20 초 동안 샘플을 균질 수 있습니다.
- 핵 단백질의 단지의 완전한 분리를 허용하기 위해 5 분 동안 실온에서 샘플을 품어.
- 20 분 얼음 쿨 샘플
- 각각의 샘플 및 와동 200 μL (사람마다 ML Trizol) 클로로포름을 추가합니다.
- 다섯 분 실온에서 샘플을 품어.
- 4 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 ° C를 15 분.
- 새로운 Eppendorf 튜브 (계면 지역 및 로우어 레드, 페놀 - 클로로포름 단계를 피하는)에 수성 단계 (명확 상단 레이어)를 전송합니다. RNA는 명확 수성 단계에 남아 있습니다.
- RNA 격리 및 저장을위한 일반적인 기법을 이제 사용할 수 있습니다.
- 다음 RNA 추출, 리버스 transcriptase 실시간 PCR을위한 상용 키트는 종종 일부 수정 (Elisseff 외., Strehin 외.)으로 사용됩니다.
- 고정 및 탈수
대표 결과 :
photopatterned hydrogels 및 젤류 내에서 세포의 캡슐의 시각화의 대표적인 결과를 그림 2-4 (로 위의 프로토콜에서 참조)를 참조하십시오.
그림 1. 3D 캡슐 절차의 개요. 다이어그램 단계 stepwise 프로토콜 섹션 제목과 일치합니다.
연속 마이클 형 외에 다음 급진 중합을 사용하여 그림 2. Photopatterned의 히드로겔. 사진 반응의 색소의 설립과 함께 부분적으로 가교 히드로겔의 photopatterning의 (A) 도식. (B) 서클 또는 (C) 스트 라이프 투명 필름 마스크 hyaluronic 산성 hydrogels를 패턴. Methacrylated rhodamine (MeRho)는 오직 조명에 노출되었던 젤의 지역에서 통합됩니다. 스케일 바 = 100 μm의.
그림 3. 차원 hydrogels에서 세포의 시각화. 줄기 세포는 (a) 가벼운 현미경을 통해 시각 또는 (b) 라이브 (녹색, Calcein AM)와 죽은 (빨강, Ethidium homodimer - 1) 얼룩 24 시간 조명을 통해 가교 hyaluronic 산성 히드로겔에서 1,000,000 세포 / ML에서 캡슐을 따라 자유 라디칼 메커니즘을 시작하였습니다. 스케일 바 = 100 μm의.
그림 4. 차원 hydrogels에서 세포의 시각화. hMSCs는 (마이클 타입 메커니즘을 통해 가교 hyaluronic 산성 히드로겔에서 1,000,000 세포 / ML에서 캡슐 다음 (A) 라이브 셀 (Calcein AM) 또는 (b) 세포 굴지 (rhodamine phalloidin)과 핵 (DAPI) 5 일간 스테인드 ) 펜던트 접착제의 펩티드 및 bifunctional proteolytically 분해 펩티드 crosslinkers를 사용합니다. 스케일 바 = 100 μm의.
Discussion
설명 프로토콜 cytocompatible 방식으로 히드로겔 공사장 공중 발판 내에서 세포를 캡슐로 간단하고 강력한 방법을 나타냅니다. 말기 차별화된 이후 이러한 기술은 특히 중요하고 줄기 세포는 2D 3D microenvironments에 비해 현저하게 다른 동작을 수 있습니다. 도 자료의 주입 (예에서 현장 급진 중합), 세포 캡슐화 및 생존과 차별에 대한 분석을 포함하는 치료 방법에 대한 소재 개발 과정에서 도움이 될 수 있습니다. 설명 순차 프로세스 공간 히드로겔 환경을 조작하는 데 사용하고, 따라서 세포의 행동 (Khetan 외를 참조하십시오.)하실 수 있습니다.
전체 설명 프로토콜의 가장 중요한 요소는 사용되는 모든 솔루션의 균질성입니다. 특히, 특별한주의가 crosslinker 솔루션뿐만 아니라 다음 피펫 resuspension에 의해 세포가 균일하게 예비 중합체 솔루션에 배포하고 있으며, 해결이 잘 혼합되도록로 이동해야합니다. 이것을 보장하기 위해 실패하면 셀 또는 겔 구조와 붓기 지역 유사 clumping 발생할 수 있습니다.
프로토콜 여기 캡슐 세포에 대한 절차에 주로 초점을 제시하지만, 그것은 캡슐 일반적으로 2D 시딩용으로 작성된 분석 프로토콜을 일부 조정이 필요한 수도주의하는 것이 중요합니다. 몇 가지 예제가 hydrogels에 세포를 시각화 및 평가를위한 그림했다.
Acknowledgments
이 작품은 SK와 히스 부여 R01EB008722 국립 연구소에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원의 연구 활동에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| .2 M Triethanolamine Buffer | Reagent | Sigma-Aldrich | T0449 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | 1x, sterile liquid |
| Live/Dead staining kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes |
| Phalloidin-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | P5282 | |
| Rhodamine Phalloidin | Reagent | Invitrogen | R415 | |
| DAPI | Reagent | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho) | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591 | |
| Bovine Serum Albumin | Reagent | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Citrisolv | Reagent | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Micro-cut paraffin | Reagent | Polysciences, Inc. | 24202 | |
| Trizol reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| 0.22 μm pore size nylon syringe filters | Equipment | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 mL disposable syringes | Equipment | BD Biosciences | 309602 | Cut syringes at consistent height for UV exposure |
| Wide orifice pipette tips | Equipment | Sigma-Aldrich | P6800 | |
| Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| 254 nm germicidal UV light source | Equipment | Built into most biological safety cabinets |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).
- Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A.
- Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C.
- Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks. Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).
- Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels. Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells. Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).
- Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels. Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).
- Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels. Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).
