Summary
Nós apresentamos os protocolos para o 3-dimensional encapsulamento (3D) de células dentro de hidrogéis sintéticos. O procedimento de encapsulamento é descrito por dois métodos comumente utilizados de reticulação (michael tipo adição e light-iniciado livre mecanismos radical), bem como uma série de técnicas para avaliar o comportamento das células encapsuladas.
Abstract
O encapsulamento 3D de células dentro de hidrogéis representa uma técnica cada vez mais importante e popular para a cultura de células e para o desenvolvimento de construções para engenharia de tecidos. Este ambiente melhor imita o que observar células in vivo, em comparação à cultura de tecidos padrão, devido às propriedades do tecido-como e ambiente 3D. Sintéticos hidrogéis poliméricos são água-inchados redes que podem ser projetados para serem estáveis ou de degradar por hidrólise ou proteólise como o tecido novo é depositado por células encapsuladas. Uma grande variedade de polímeros têm sido exploradas para estas aplicações, tais como poli (etileno glicol) e ácido hialurônico. Mais comumente, o polímero é funcionalizado com grupos reativos, como metacrilatos ou acrilatos capaz de sofrer reticulação através de vários mecanismos. Na última década, muitos progressos foram feitos na engenharia destes microambientes - por exemplo, via a incorporação física ou pingente covalentes de pistas bioquímicos - para melhorar a viabilidade e direta fenótipo celular, incluindo a diferenciação de células-tronco encapsulado (Burdick et al.).
Os métodos a seguir para o encapsulamento de células em 3D foram otimizadas em nosso e outros laboratórios para maximizar cytocompatibility e minimizar o número de etapas de processamento hidrogel. Nos protocolos a seguir (ver Figura 1 para uma ilustração do processo), presume-se que os polímeros funcionalizados capaz de sofrer reticulação estão já em curso; excelentes críticas de química de polímeros, aplicada ao campo da engenharia de tecidos pode ser encontrada em outro lugar (Burdick et al.) e esses métodos são compatíveis com uma gama de tipos de polímeros. Além disso, a adição do tipo Michael (ver Lutolf et al.) E leve-iniciada de radicais livres (veja Elisseeff et al.) Mecanismos enfocado aqui constituem apenas uma pequena parte das técnicas de reticulação relatados. Crosslinking modo misto, em que uma parte de grupos reativa é consumida inicialmente pelos crosslinking adição e seguido por um mecanismo de radical, é um outro paradigma comumente utilizado e poderoso para dirigir o fenótipo de células encapsuladas (Khetan et al., Salinas et al.).
Protocol
A. Preparação de Material e Esterilização
- Antes de materiais de encapsulamento preparar, preparar uma solução 0,5% em peso do fotoiniciador IRGACURE 2959 (I2959) em tampão fosfato salino (PBS), através da mistura e incubando por vários dias a 37 ° C. A solução pode então ser filtrado seringa para esterilização e armazenados em temperatura ambiente por uso a longo prazo.
- Com base na composição desejada de gel para ser sintetizada, calcular (usando um programa de planilha como o Microsoft Excel) o peso de polímero e reticulador necessário. Porque um determinado peso de polímero deve ser dissolvido em um volume definido total para obter uma concentração desejada no hidrogéis, o reticulador e porções solução de polímero do volume total de gel também deve ser determinado usando a planilha. Cálculos similares devem ser feitos se houver pendant metades (por exemplo, um adesivo ou RGD YGSR contendo oligopeptídeos), devem ser incorporados antes da reticulação.
- Pesar a quantidade necessária de polímero e reticulador e colocar em tubos Eppendorf. Ajustar a planilha de cálculo em conformidade, para o peso real do polímero obtido. (Nota: os volumes podem ser alterados para compensar a massa real de polímero e reticulador obtidos).
- Prepare moldes gel usando uma lâmina de barbear para cortar os topos fora embalada individualmente estéril seringas de 1 mL descartáveis. Certifique-se cortar um apartamento é feita em moldes a ser utilizado para géis photopatterned.
- Coloque os moldes seringa, tubos Eppendorf (com tampa aberta) e quaisquer outros materiais necessários sob uma fonte de luz germicida (normalmente construídos em cabines de segurança biológica) e esterilizar por 30 minutos.
B. Preparação celular
- Após a esterilização, adicione o volume tampão estéril apropriada (por cálculos de planilhas, enquanto a escolha de buffer pode variar, PBS e um buffer de base fraca, como trietanolamina são tipicamente usados para reticulação radical e michael-tipo livre, respectivamente) para o polímero e Eppendorf (opcionalmente) moiety pendente para ser incluído (por exemplo, peptídeo adesivo) e vortex para dissolver (se vórtex fora do envoltório estéril capa da Eppendorf com parafilme).
- Adicionar o volume apropriado da solução porção pendente para a solução de polímero e enrole o selo com parafilme. Brevemente vortex e incubar a 37 ° C para reagir (se possível, em cima de uma placa de agitação rotativo) durante a preparação da célula. Isso envolve a reação de um tiol em um peptídeo (via grupo cisteína) para um acrilato ou metacrilato para que o peptídeo é incluído como um grupo pendente no hidrogel final.
- Trypsinize e contagem de células e separadas em porções contendo o número apropriado para cada conjunto de géis. Por exemplo, para um conjunto de três géis 50 mL com uma densidade de 10 milhões de células / mL, separe 1,5 milhões de células em um tubo cônico individuais. Recomenda-se que não mais de 4 géis ser preparado em um conjunto de individuais devido ao tempo de gelificação (nota: se sintetizar vários conjuntos de géis, um único Eppendorf contendo um volume adequado de solução de polímero para todos os conjuntos podem ser preparados).
- Centrifugar as células.
- Enquanto as células estão girando para baixo
- Luz iniciou crosslinking radicais livres: adicionar 0,5% em peso I2959 solução para a solução de polímero igual a 10% do volume total gel set (para uma concentração final de iniciador de 0,05% em peso).
- Michael tipo de reticulação (adição): adicionar buffer para o reticulador para alcançar a solução de concentração adequada.
- Para crosslinking seqüencial: esses géis incorporar ambos os tipos de crosslinking e exigem tanto das etapas anteriores.
C. Formação Hydrogel
- Aspirar o sobrenadante da porção de células centrifugadas. Aguarde líquido para resolver após a aspiração inicial e re-aspiração para remover a mídia, tanto quanto possível, sem perturbar o pellet celular.
- Ressuspender o pellet celular com a solução de polímero até que as células estão uniformemente distribuídas. Minimizar a formação de bolhas por pipetagem lentamente a solução cima e para baixo (cerca de 10 ciclos deve ser suficiente para distribuir células).
- Hidrogéis de reticulação
- Luz iniciou crosslinking radicais livres: Alíquota o volume adequado em moldes da seringa. Expor as seringas à luz UV para crosslinking radical (por exemplo, uma exposição de 10 minutos a 365 nm, 4 luz UV mW/cm2 é comum para os polímeros funcionalizados acrilato). Esta etapa deve ser realizada rapidamente para minimizar a sedimentação de células antes da exposição à luz UV.
- Michael tipo de reticulação (adição): Usando uma gama de orifício ponta da pipeta, adicionar o volume adequado de solução reticulador para a solução de polímero / célula, defina a pipeta no volume desejado gel individual, pipeta a solução cima e para baixohomogeneizar, e alíquota nos moldes da seringa. Esta etapa deve ser realizada rapidamente para garantir uma distribuição uniforme de células. Permitir 10-30 minutos (dependendo do sistema individual) de incubação na capa de cultura para crosslinking.
- Crosslinking seqüencial: Trata-se da reação de adição do tipo Michael em primeiro lugar e, em seguida, a exposição à luz para o crosslinking segundo. Apenas uma fração de ligações cruzadas teóricas devem ser reagido durante o crosslinking primeiro e depois uma máscara estéreis deve ser aplicado diretamente sobre a superfície do gel antes da exposição à luz, usando uma pinça esterilizada. Um corante funcionalizados (rodamina, por exemplo, methacrylated (MeRho) numa concentração final no gel de 20 nM) também pode ser adicionado à solução inicial para visualizar a padronização, uma vez que irá incorporar preferencialmente em regiões radicalmente reticulado do gel (Figura 2 ).
D. Cultura de Células e Análise
- Crosslinking seguinte, géis mergulhar em poços de uma placa de cultura de tecido contendo mídia para incubação e análise (ver passos seguintes).
- As células podem ser visualizadas para a morfologia em microscopia de luz (Figura 3, normalmente, sintetizados hidrogéis são transparentes) e viabilidade usando um kit de coloração fluorescente vivo / morto (Figuras 3 e 4). Coloração para celular actina (por exemplo, rodamina ou fluoresceína rotulados phalloidin) e núcleos (por exemplo, 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) pode ser realizada utilizando fixação padrão e procedimentos de permeabilização (Figura 4) com o seguinte procedimento.
- Enxágüe constrói 3X por 5 minutos com PBS.
- Fix géis de incubação em 1 mL de formaldeído 4% por 30 min em temperatura ambiente.
- Enxágüe constrói 3X com solução bloqueadora contendo 3% (w / v) e 0,5% BSA (w / v) em PBS Tween.
- Permeabilizar membrana com 0,25% (w / v) de Triton X em solução de bloqueio por 20 min.
- Enxágüe constrói 3X com solução de bloqueio.
- Mancha para a F-actina com 0,66 mcg / mL FITC ou rodamina phalloidin em solução de bloqueio de duas horas à temperatura ambiente.
- Enxágüe 3x com solução de bloqueio.
- Mancha núcleos celulares usando 0,4 mL / mL DAPI em PBS por 20 min.
- Enxágüe 3X com PBS.
- Visualize células usando microscopia de epifluorescência ou confocal.
- Proliferação de células dentro de gel é comumente avaliada utilizando ensaios comercialmente disponíveis (DNA, por exemplo, o conteúdo total ou bioquímicas). PicoGreen é comumente usado e sensível ácido nucléico mancha fluorescente para quantificar double-stranded DNA (Singer et al.). As células também podem ser contados e normalizado para um número de controle inicial usando os métodos de visualização descrito na Etapa 2.
- Corte histológico e coloração também pode ser usado para visualizar as células e formado matriz. O seguinte protocolo para a desidratação e secção de hidrogéis 3D pode ser usado para obter fatias transversais em lâminas de vidro:
- Fixação e desidratação
- Enxágüe espécime 3X no PBS.
- Correção para 5-30 minutos em paraformaldeído a 4%.
- Enxágüe espécime 3X no PBS.
- Incubar amostra em EtOH a 25 ° C por 1 hora em cada um dos seguintes EtOH (v / v) as concentrações na água (em ordem): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (Neste ponto, as amostras pode ser armazenado durante a noite a 25 ° C).
- Compensação e de Infiltração
- Transferência de 100% Citrisolv para 1 hora a 25 ° C, seguido por uma hora a 65 ° C.
- Cortadas amostras ao meio com uma lâmina de barbear numa placa de Petri de tal forma que a seção transversal da amostra está exposta.
- Transferência para 1:1 mistura de Citrisolv / Micro-cut de parafina para 1 hora a 65 ° C.
- Transferência de 100% parafina Micro-corte para 1 hora a 65 ° C.
- Transferência de 100% parafina Micro-cut durante a noite a 65 ° C.
- Transferência de 100% parafina Micro-cut por 1-2 horas a 65 ° C.
- Incorporação
- Espécime posição no molde peel-away com parafina de 100%.
- Coloque uma pequena quantidade de cera na cama molde, e insira as duas metades da amostra com a seção transversal voltada para baixo.
- Aplicar parte superior do filtro
- Adicionar cera adicionais para submergir a parte superior e deixe endurecer por ~ 10 minutos.
- Transferência insere a 4 ° C para permitir a geladeira para endurecer espécime durante a noite.
- Amostra pode ser seçãoed no dia seguinte, normalmente a espessura de 50-10 mM por fatia usando micrótomos disponíveis comercialmente. Normalmente o molde peel-away é montado verticalmente contra o estágio micrótomo, e controles manuais são usados para definir a seção de espessura slicer e alinhamento da amostra com a lâmina.
- Extração de RNA
Expressão do gene também pode ser avaliada quantitativamente (por exemplo, via em tempo real, reação em cadeia da polimerase (PCR)). O protocolo para extração de RNA a partir de hidrogéis 3D, um exemplo de que é dado a seguir, é bastante diferente do caso mais simples em 2D.- Rotular um certificado RNAse tubo Eppendorf para cada hidrogel 3D e adicionar 500 mL Trizol ® reagente em cada tubo.
- Use um pilão (moedor de tecido) para moer os hidrogéis manualmente até que uma solução clara é obtido. Moedores de garantir diferentes são usados para cada condição.
- Vortex cada Eppendorf por 20 segundos para homogeneizar as amostras.
- Incubar as amostras à temperatura ambiente por cinco minutos para permitir a dissociação completa dos complexos de nucleoproteínas.
- Amostras fresco no gelo por 20 min
- Adicionar 200 mL (por mL Trizol) clorofórmio para cada amostra e vortex.
- Incubar as amostras à temperatura ambiente por cinco min.
- Centrifugar as amostras a 12.000 xg, a 4 ° C por 15 min.
- Transferir a fase aquosa (camada superior transparente) para novos tubos Eppendorf (evitando região interfacial e inferior vermelha, fase de fenol-clorofórmio). RNA permanece na fase aquosa.
- Técnicas comuns para o isolamento do RNA e armazenamento pode ser usado agora.
- Extração de RNA seguinte, kits comercialmente disponíveis para transcriptase reversa e PCR em tempo real são muitas vezes utilizados com algumas modificações (Elisseff et al. Strehin et al.).
- Fixação e desidratação
Resultados representativos:
Veja as Figuras 2-4 (como referenciado nos protocolos acima) para obter resultados representativos da visualização de hidrogéis photopatterned e encapsulamento de células dentro de géis.
Figura 1. Visão geral do processo de encapsulamento 3D. Passos diagrama correspondem a títulos de seção na protocolos stepwise.
Figura 2. Hidrogel Photopatterned usando polimerização adição sequencial do tipo Michael então radical. (A) Esquema de photopatterning de um hidrogel reticulado parcialmente com a incorporação de um corante reativo foto. (B) ou círculo (C) tarja máscara de filme de transparência padronizada hidrogéis de ácido hialurônico. Rodamina Methacrylated (MeRho) é incorporado apenas nas regiões do gel que foram expostos à luz. Barra de escala = 100 mm.
Figura 3. Visualização de células em hidrogéis 3D. Células-tronco visualizado através de (a) microscopia de luz ou (b) ao vivo (verde, calceína AM) e mortos (vermelho, homodímero de etídio-1) coloração de 24 horas após o encapsulamento de 1 milhão de células / mL em um hidrogel de ácido hialurônico reticulado através de uma luz iniciado mecanismo de radical livre. Barra de escala = 100 mm.
Figura 4. Visualização de células em hidrogéis 3D. hMSCs coradas para (a) células vivas (calceína AM) ou (b) celulares actina (rodamina phalloidin) e núcleos (DAPI) cinco dias após o encapsulamento de 1 milhão de células / mL em um hidrogel de ácido hialurônico reticulado através de um mecanismo do tipo Michael ( usando peptídeos pendant adesivo e reticuladores peptídeo bifuncional proteoliticamente degradável). Barra de escala = 100 mm.
Discussion
Os protocolos descritos representam um método simples e poderoso para encapsular células dentro de andaimes hidrogel de forma cytocompatible. Tais técnicas são especialmente importante, uma vez terminalmente diferenciadas e células-tronco podem exibir um comportamento marcadamente diferente em microambientes 2D versus 3D. Mesmo para abordagens terapêuticas que envolvem a implantação de materiais (por exemplo, em polimerização in situ radical), encapsulamento de células e análise de viabilidade e diferenciação pode ajudar no processo de desenvolvimento material. O processo descrito seqüencial pode ser usada para manipular o ambiente espacial de hidrogel, e, consequentemente, o comportamento celular (ver Khetan et al.).
No geral, o elemento mais crítico dos protocolos descritos é a homogeneidade de todas as soluções utilizadas. Em particular, cuidados especiais devem ser tomados para garantir as células estão uniformemente distribuídas na solução de pré-polímero, e que a solução está bem misturado, ressuspensão pipeta após adição da solução de agente reticulante. Não garantir isso pode levar a aglomeração de células ou variações locais na estrutura de gel e inchaço.
Enquanto os protocolos apresentados aqui se concentram principalmente sobre o procedimento para as células encapsulamento, é importante notar também que o encapsulamento podem necessitar de algum ajuste de protocolos de análise que normalmente são escritos para semeadura 2D. Vários exemplos foram ilustrados para visualizar e avaliar as células em hidrogéis.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por um National Science Foundation Graduate Fellowship Research para SK e National Institutes of Heath conceder R01EB008722.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| .2 M Triethanolamine Buffer | Reagent | Sigma-Aldrich | T0449 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | 1x, sterile liquid |
| Live/Dead staining kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes |
| Phalloidin-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | P5282 | |
| Rhodamine Phalloidin | Reagent | Invitrogen | R415 | |
| DAPI | Reagent | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho) | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591 | |
| Bovine Serum Albumin | Reagent | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Citrisolv | Reagent | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Micro-cut paraffin | Reagent | Polysciences, Inc. | 24202 | |
| Trizol reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| 0.22 μm pore size nylon syringe filters | Equipment | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 mL disposable syringes | Equipment | BD Biosciences | 309602 | Cut syringes at consistent height for UV exposure |
| Wide orifice pipette tips | Equipment | Sigma-Aldrich | P6800 | |
| Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| 254 nm germicidal UV light source | Equipment | Built into most biological safety cabinets |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).
- Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Cell-Responsive Synthetic Hydrogels. Adv Mater. 15, 888-892 (2003).
- Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. Cellular Photoencapsulation in Hydrogels. Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).
- Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks. Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).
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