Summary
Biz, sentetik hidrojeller içinde hücreler 3 boyutlu (3D) kapsülleme için protokolleri mevcut. Kapsülleme işlemi kapsüllü hücre davranışlarını değerlendirmek için iki yaygın olarak kullanılan çapraz bağlanma yöntemleri (michael-tipi hafif başlatılan ek ve serbest radikal mekanizmaları) yanı sıra bir dizi teknik özetlenmiştir.
Abstract
Hidrojeller içinde hücre 3D kapsülleme giderek daha önemli ve popüler kültür hücreleri ve doku mühendisliği yapılarının geliştirilmesi yönünde bir tekniği temsil eder. Bu ortam daha iyi doku gibi özellikleri ve 3D ortamı nedeniyle, standart doku kültürü ile karşılaştırıldığında, hücrelerin in vivo olarak görüyoruz ne taklit eder . Sentetik polimerik hidrojeller suda şişmiş ağları istikrarlı veya yeni doku kapsüllü hücreleri tarafından tevdi hidroliz veya proteoliz yoluyla aşağılamak için tasarlanmış olabilir. Poli (etilen glikol) ve hyaluronik asit gibi bu uygulamalar için bir çok çeşitli polimerler araştırılmıştır. En sık, polimer gibi metakrilat veya çeşitli mekanizmalar aracılığıyla crosslinking geçiren yetenekli akrilatlar gibi reaktif grupları ile işlevselleştirildiyse. Kapsüllü kök hücreler (. Burdick ve ark.) Farklılaşma da dahil olmak üzere uygulanabilirliği ve doğrudan hücre fenotipi geliştirmek için biyokimyasal ipuçlarının, fiziksel ya da askılı kovalent ortaklık yoluyla, örneğin son on yıl içinde çok ilerleme mühendislik bu mikroçevrelerde yapılmış oldu.
Hücre 3D kapsülleme için aşağıdaki yöntemlerden cytocompatibility en üst düzeye çıkarmak ve hidrojel işleme adımların sayısını en aza indirmek için, bizim ve diğer laboratuvarlarda optimize edilmiştir. Aşağıdaki protokolleri (prosedürün bir örnek için bkz: Şekil 1), crosslinking geçiren yeteneğine sahip polimerler zaten elinde olduğunu varsayılır;, doku mühendisliği alanında uygulanan polimer kimyası mükemmel yorumlar başka bir yerde bulunabilir (Burdick ve ark.) ve bu yöntemlerin bir dizi polimer türleri ile uyumlu. Ayrıca, Michael tipi ek (Lutolf ark) ve serbest radikal (Elisseeff ve ark.) Mekanizmaları burada odaklanmış ışık başlatılan rapor crosslinking teknikleri sadece küçük bir bölümünü oluşturmaktadır. Reaktif grupların bir kısmı ilk ek crosslinking tarafından tüketilen ve radikal bir mekanizma tarafından takip edildiği Karma mod crosslinking, yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir kapsüllü hücreleri (Khetan ve ark. Salinas ve ark.) Fenotip yönetmek için başka bir paradigma.
Protocol
A. Malzeme Hazırlama ve Sterilizasyon
- Kapsülleme malzemelerin hazırlanması öncesinde karıştırma ve bir kaç gün 37 ° ° C için kuluçka, fosfat photoinitiator Irgacure 2959 (I2959) 0.5 ağırlıkça% çözelti hazırlamak tamponlu salin (PBS) Bu çözüm daha sonra şırınga sterilizasyonu için filtre ve uzun vadeli kullanım için oda sıcaklığında saklanan olabilir.
- Sentezlenen jellerin istediğiniz kompozisyonu dayanarak, polimer ve çapraz bağlayıcı ağırlığı (Microsoft Excel gibi bir elektronik tablo programını kullanarak) hesaplamak gerekli. Polimer Belirli bir ağırlık, hidrojeller, çapraz bağlayıcı ve toplam jel hacmi polimer çözüm bölümlerini istediğiniz bir konsantrasyon elde etmek için tanımlanmış bir toplam hacmi içinde çözünmüş olması gerekir, çünkü tablo kullanarak tespit edilmelidir. Eğer herhangi bir kolye moieties önce crosslinking dahil edilmesi (örneğin, bir yapıştırıcı RGD veya Oligopeptide içeren YGSR) Benzer hesaplamalar yapılmalıdır.
- Eppendorf tüpleri içine gerekli polimer ve çapraz bağlayıcı miktarı ve yeri tartılır. Elde edilen polimer gerçek ağırlık hesaplama tablo buna göre ayarlayın. (Not: hacimleri elde edilen polimer ve çapraz bağlayıcı gerçek kitle telafi etmek için değişmiş olabilir) .
- Jel kalıpları ayrı ayrı sarılmış steril 1 ml tek kullanımlık şırınga üstleri kesmek için jilet kullanarak hazırlayın. Emin olun düz bir kesim photopatterned jeller için kullanılacak kalıplar için yapılır.
- Şırınga kalıpları, Eppendorf tüpleri (kapaklar açık) ve antiseptik bir ışık kaynağı (genellikle biyolojik güvenlik kabinleri yerleşik) altında herhangi bir diğer gerekli malzemeleri koyun ve 30 dakika süreyle sterilize.
B. Hücre Hazırlık
- Sterilizasyon sonrasında, uygun steril tampon hacmi (elektronik tablo hesaplamaları başına; tampon seçimi, değişebilir PBS gibi trietanolamin gibi zayıf bir baz tampon genellikle serbest radikal ve michael-tipi crosslinking, sırasıyla için kullanılır.) Polimer Eppendorf ve (isteğe bağlı) kolye benzer parçaları dahil edilmesi (örneğin, yapışkan peptid) ve çözmek için vorteks (parafilm ile steril kaput şal dışında Eppendorf vorteks varsa).
- Polimer çözüm kolye benzer parçaları çözüm uygun hacim ve mühür ile parafilm sarın. Hücre hazırlanması sırasında 37 ° C tepki Kısaca vorteks ve inkübe (eğer mümkünse, döner bir heyecan plaka tepesinde). Bu peptid, son hidrojel bir kolye grup olarak dahil olduğu bir akrilat ve metakrilat peptid tiyol reaksiyonu (sistein grup üzerinden) içerir.
- Trypsinize ve hücreleri ve jeller her set için uygun sayı içeren bölümlerini ayırmak saymak. Örneğin, 10 milyon hücre / mL ayrı ayrı bir konik tüp içine 1,5 milyon hücre yoğunluğu üç 50 mcL jeller bir dizi. En fazla 4 jeller, jelleşme zamanlaması (: birden fazla set jeller sentezleme halinde, tüm setleri için yeterli miktarda polimer çözüm içeren tek bir Eppendorf hazırlanmış olabilir dikkat edin) nedeniyle bir birey olarak hazırlanmış olması tavsiye edilir.
- Hücreleri santrifüjleyin.
- Hücreleri aşağı dönerken
- Işık serbest radikal çapraz bağlanma başlatılan, toplam jel seti hacminin% 10 (0.05 ağırlıkça% nihai bir başlatıcı konsantrasyonu için) eşit polimer çözüm 0.5 ağırlıkça% I2959 çözüm ekleyin .
- Michael-tipi (ek) crosslinking uygun konsantrasyon çözüm elde etmek için çapraz bağlayıcı tampon eklemek.
- Sıralı çapraz bağlanma için: bu jeller crosslinking her iki tip dahil ve önceki adımları gerektirir.
C. Hidrojel Oluşumu
- Santrifüj hücre kısmı süpernatant aspire. Hücre pelletini bozmadan mümkün olduğunca ortamı çıkarmak için ilk aspirasyon ve yeniden aspirat sonra yerleşmek için sıvı için bekleyin.
- Polimer çözeltisi ile hücre pelletini tekrar hücreler eşit olarak dağıtılır kadar. Yavaş yavaş çözüm pipetleme tarafından kabarcık oluşumunu en aza indirmek ve aşağı (yaklaşık 10 döngü hücreleri dağıtmak için yeterli olacaktır).
- Crosslinking Hidrojeller
- Temsili miktar şırınga ucu kalıplara uygun hacmi: Işık, serbest radikal çapraz bağlanma başlattı . Radikal çapraz bağlanma için UV ışık şırınga Açığa (örneğin, 365 nm 10 dakikalık bir maruz kalma, 4 mW/cm2 UV ışık akrilat sahip polimerler için yaygın olarak). Bu adım, hücre, UV ışık maruz önce yerleşen en aza indirmek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
- Michael-tipi (ek) crosslinking: geniş bir orifis pipet kullanarak, polimer / hücre çözümü için uygun çapraz bağlayıcı çözüm hacmi eklemek istenen bireysel jel hacmi pipet, çözüm pipeti ve aşağıhomojenize ve şırınga ucu kalıplar içine kısım. Bu adım, hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. 10-30 dakika (bireysel sistemin bağlı) kültür crosslinking kaputu inkübasyon izin verin.
- : Sıralı crosslinking sonra Michael-tip yanı sıra ilk tepkisi ve ikinci crosslinking ışığa maruz içerir. Teorik çapraz bağları sadece bir kısmını ilk çapraz bağlanma sırasında reaksiyona girer ve daha sonra steril bir maske jel yüzeyine steril cımbız kullanarak ışığa maruz önce doğrudan uygulanabilir olmalıdır. Jel radikal çapraz bölgelerde tercihen bir araya getirecek bir Fonksiyonlu boya (örneğin 20 nM jel nihai bir konsantrasyonda, methacrylated rodamin (MeRho)) (Şekil 2, desenlendirme görselleştirmek için ilk çözüm olabilir .)
D. Hücre Kültürü ve Analiz
- Ardından çapraz bağlanma, kuluçka ve analiz için medya içeren bir doku kültürü plaka kuyu atılmak jelleri (bkz. aşağıdaki adımları).
- Floresan ölü / canlı boyama kiti (Şekil 3 ve 4) kullanarak ve canlılığı, hücreleri morfolojisi ışık mikroskobu (genellikle, sentezlenmiş hidrojeller şeffaf Şekil 3) kullanılarak görüntülendi olabilir. Hücresel aktin (örneğin, rodamin ya da floresein Phalloidin etiketli) ve çekirdekler için (örneğin, 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) Boyama, aşağıdaki yordamı ile standart fiksasyon ve permeabilization prosedürleri (Şekil 4) kullanılarak yapılabilir.
- PBS ile 5 dk 3X yapıları durulayın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika için 1 ml% 4 formaldehit inkübasyon jeller sabitleyin.
- 3X yapıları engelleme çözümü içeren% 3 (w / v) BSA ve% 0,5 (w / v) PBS içinde Tween ile durulayın.
- % 0.25 'lik (w / v) 20 dakika için çözüm engelleme Triton X ile membran Permeabilize.
- 3X yapıları çözümü engelleme ile durulayın.
- 0.66 mcg / ml FITC veya oda sıcaklığında iki saat için bir çözüm engelleme rodamin Phalloidin ile F-aktin Leke.
- Çözümü engelleme 3x durulayın.
- 20 dakika için 0.4 mcL / ml DAPI PBS kullanarak hücre çekirdekleri Leke.
- PBS ile 3 kere yıkayın.
- Epifluorescent veya konfokal mikroskopi kullanılarak hücrelerin gözünüzde canlandırın.
- Jeller içinde hücrelerin çoğalması yaygın olarak piyasada mevcut testlerin (örneğin, toplam DNA veya biyokimyasal içeriği) kullanılarak değerlendirildi. PicoGreen çift iplikli DNA miktarının belirlenmesi için leke yaygın olarak kullanılan ve hassas bir floresan nükleik asit (Singer ve ark.) . Hücreler de sayılır ve Adım 2'de açıklanan görüntüleme yöntemleri kullanılarak bir başlangıç kontrol numarası normalize olabilir.
- Histolojik kesit alma ve boyama hücreleri görselleştirmek ve matris oluşan kullanılabilir. 3D hidrojellerin dehidratasyon ve kesit için aşağıdaki protokol cam slaytlar kesitsel dilimler elde etmek için kullanılabilir:
- Fiksasyon ve dehidratasyon
- PBS içinde örnek 3X durulayın.
- 5 - 30 dakika için% 4 paraformaldehid Fix.
- PBS içinde örnek 3X durulayın.
- 25 EtOH örnek inkübe ° C aşağıdaki EtOH (v / v) su konsantrasyonları (sırayla), her 1 saat:% 50,% 70,% 95,% 95,% 100 (Bu noktada, örnekler 25 gece boyunca saklanabilir ° C).
- Takas ve infiltrasyon
- 1 saat 25 ° C, bir saat 65 ° C için% 100 Citrisolv transfer
- Numunenin kesit maruz kaldığı bu tür bir Petri kabındaki bir jilet ile yarım örnekleri kesin.
- 65 1 saat için Citrisolv / Mikro-cut Parafin 1:1 karışım transfer ° C.
- 65 1 saat süreyle% 100 Micro-cut Parafin Transfer ° C.
- 65 yaşında bir gecede% 100 Micro-cut Parafin Transfer ° C.
- 65 az 1-2 saat süreyle% 100 Micro-cut Parafin Transfer ° C.
- Gömülmesi
- % 100 parafin ile peel-away kalıp pozisyon örnek.
- Kalıp yatakta mum küçük bir miktar yerleştirin ve örnek iki yarısı kesit aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
- Üst filtre parça uygulayın
- Üst parça batığın ek balmumu ekleyin ve 10 dakika için sertleşmesine izin.
- 4 ° C buzdolabı sertleşmesine örnek bir gecede izin ekler aktarın.
- Numune bölümü olabilired ertesi gün, genellikle piyasada mevcut Mikrotomlar kullanarak dilim başına 5-10 mikron kalınlığında. Genellikle peel-away kalıp mikrotom aşamada karşı dikey olarak monte edilir ve manuel kontroller bıçak ile örnek kesit kalınlığı, dilimleme makinesi ve hizalama ayarlamak için kullanılır.
- RNA Ekstraksiyon
Gen ifadesi de (örneğin, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile) kantitatif olarak değerlendirilebilir. RNA ekstraksiyon, aşağıda verilen bir örnek, 3D hidrojeller için protokol daha basit 2B durumu oldukça farklı.- Her 3D hidrojel için onaylı bir RNAse ücretsiz Eppendorf tüp etiket ve her bir tüpe 500 mcL Trizol ® reaktif ekleyin.
- Net bir çözüm elde edilinceye kadar hidrojeller el öğütmek için bir havaneli (doku değirmeni) kullanın. Emin olun farklı öğütücüler, her durum için kullanılır.
- Vorteks her 20 saniye için Eppendorf örnekleri homojenize.
- Nükleoprotein kompleksleri tam ayrılma izni için, beş dakika boyunca oda sıcaklığında numune inkübe edin.
- Cool 20 dakika buz örnekleri
- 200 mcL (kisi ml Trizol) kloroform, her örnek ve vorteks ekleyin.
- Beş dakika süreyle oda sıcaklığında numune inkübe edin.
- 4 12,000 xg'de santrifüjleyin ° C 15 dakika.
- Yeni Eppendorf tüpleri (arayüzey bölgesi ve düşük kırmızı, fenol-kloroform faz kaçınarak) sulu faz (şeffaf üst tabaka) aktarın. RNA berrak sulu faza kalır.
- RNA izolasyonu ve depolama için ortak teknikler kullanılabilir.
- Aşağıdaki RNA ekstraksiyon, ters transkriptaz ve real-time PCR için ticari kitler mevcuttur sık sık bazı değişiklikler (Elisseff ve ark. Strehin ve ark.) Kullanılır.
- Fiksasyon ve dehidratasyon
Temsilcisi Sonuçlar:
Photopatterned hidrojeller ve jeller içinde hücre kapsülleme görselleştirme temsilcisi sonuçlar için Şekil 2-4 (yukarıdaki protokolleri başvurulan) bakın.
Şekil 1. Genel Bakış 3D kapsülleme prosedürü. Diyagram adımları adım adım protokoller bölüm başlıkları karşılık.
Şekil 2 sıralı Michael-tipi ek radikal polimerizasyonu kullanarak Photopatterned hidrojel. (A), bir fotoğraf reaktif boya dahil ile kısmen çapraz hidrojel photopatterning şematik. (B) Daire veya (C) şerit asetat film maskesi hyaluronik asit hidrojeller desenli. Methacrylated rodamin (MeRho), sadece ışığa maruz jel bölgelerde kurulmuştur. Ölçek bar = 100 mm.
Şekil 3 3D hidrojeller hücrelerin Görselleştirme. Kök hücreler, (a) ışık mikroskobu aracılığı ile görsel veya (b) canlı (yeşil Calcein AM) ve ölü (kırmızı, Ethidium homodimer-1) boyama 24 saat ışık ile çapraz bağlı hyaluronik asit hidrojel 1 milyon hücre / mL kapsülleme serbest radikal mekanizması başlattı. Ölçek bar = 100 mm.
Şekil 4 3D hidrojeller hücrelerin Görselleştirme. hMSCs (Michael-tipi bir mekanizma yoluyla çapraz bağlı hyaluronik asit hidrojel 1 milyon hücre / mL kapsülleme aşağıdaki (a) canlı hücreler (Calcein AM) veya (b) hücresel aktin (rodamin Phalloidin) ve çekirdekler (DAPI) beş gün için boyanmış kolye yapışkan peptidler ve bifonksiyonel proteolitik parçalanabilir peptid crosslinkers kullanarak). Ölçek bar = 100 mm.
Discussion
Açıklanan protokoller cytocompatible bir şekilde hidrojel iskeleleri içinde hücrelerin saklanması için basit ve güçlü bir yöntemi temsil eder. Terminal farklılaşmış beri böyle teknikler, özellikle önemli olan ve kök hücreler, 2D karşı 3D mikroçevrelerde oldukça farklı davranış gösterirler. Bile tedavi yaklaşımları içeren malzemelerin implantasyon (örneğin, in situ radikal polimerizasyonu), hücre kapsülleme ve canlılığı ve farklılaşması için analizi için materyal geliştirme sürecinde yardımcı olabilir. Açıklanan ardışık süreç mekansal hidrojel ortamda işlemek için kullanılan ve dolayısıyla hücresel davranış (Khetan ve ark.) Olabilir.
Genel olarak, açıklanan protokollerin en önemli unsur, kullanılan tüm çözümleri homojenliği. Özellikle, özel bakım, çapraz bağlayıcı bir çözüm aşağıdaki ek pipet tabanda hücreler eşit prepolimer çözüm dağıtılır ve çözüm iyice karıştırılır olduğunu sağlamak için alınmalıdır. Bunu sağlamak için başarısız hücreleri veya jel yapısı ve şişlik yerel farklılıklar topaklanma yol açabilir.
Protokolleri encapsulating hücreler için prosedürü üzerine yoğunlaşılmıştır takdim ederken, kapsülleme genellikle 2D tohumlama için yazılmış analiz protokolleri bazı ayarlamalar gerekebilir da dikkat etmek önemlidir. Hidrojeller hücrelerin görselleştirilmesi ve değerlendirmek için bazı örnekler gösterilmiştir.
Acknowledgments
Bu çalışma, SK ve Heath National Institutes hibe R01EB008722 bir Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| I2959 | Reagent | Ciba Specialty Chemicals | ||
| .2 M Triethanolamine Buffer | Reagent | Sigma-Aldrich | T0449 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | 1x, sterile liquid |
| Live/Dead staining kit | Reagent | Invitrogen | L3224 | Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes |
| Phalloidin-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | P5282 | |
| Rhodamine Phalloidin | Reagent | Invitrogen | R415 | |
| DAPI | Reagent | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho) | Reagent | Polysciences, Inc. | 23591 | |
| Bovine Serum Albumin | Reagent | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Tween 20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Citrisolv | Reagent | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Micro-cut paraffin | Reagent | Polysciences, Inc. | 24202 | |
| Trizol reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| 0.22 μm pore size nylon syringe filters | Equipment | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 1 mL disposable syringes | Equipment | BD Biosciences | 309602 | Cut syringes at consistent height for UV exposure |
| Wide orifice pipette tips | Equipment | Sigma-Aldrich | P6800 | |
| Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter | Equipment | EXFO | S1000 | |
| 254 nm germicidal UV light source | Equipment | Built into most biological safety cabinets |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).
- Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. Cell-Responsive Synthetic Hydrogels. Adv Mater. 15, 888-892 (2003).
- Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. Cellular Photoencapsulation in Hydrogels. Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).
- Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks. Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).
- Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels. Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells. Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).
- Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels. Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).
- Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels. Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).
