Summary
يصف هذا العمل من الإجراءات الأساسية موسع التصوير بالرنين المغناطيسي والحيوانات الصغيرة MRS
Abstract
وقد برزت الحيوانية بالرنين المغناطيسي الصغيرة (MR) البحوث باعتبارها عنصرا هاما من البحوث الطبية الحيوية الحديثة نظرا لطبيعة غير الغازية ، وثراء المعلومات البيولوجية التي يقدمها. MR لا يتطلب أي الإشعاعات المؤينة ويمكن أن توفر دقة أعلى noninvasively وأفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء بالمقارنة مع غيرها من تصوير الشعاعي الطبقي أو الطرائق الطيفية. في هذا البروتوكول ، سوف نركز على الحيوانات الصغيرة وMR MR التصوير الطيفي (MRI / MRS) للحصول على الاسترخاء noninvasively الموزون
Protocol
الجزء 1 : السلامة المغناطيس
كل من التصوير بالرنين المغناطيسي وMRS استخدام حقل مغناطيسي قوي يتطلب الحذر الشديد. على سبيل المثال ، صك 4.7 T التي استخدمناها لهذا العمل لديها ما يقرب من 90000 المجال المغناطيسي مرات مجال الأرض المغناطيسي. الحقل المغناطيسي عالية دائما على حتى عندما لا الماسح MR المستخدمة. وسوف يكون هناك أي جسم معدني التي تأتي في اتصال مع هذه المجال المغناطيسي بقوة وبسرعة عالية يجذبهم مغناطيس. انه امر خطير للغاية إذا كان موجودا موضوعا التجريبية أو المشغل في مسار المقذوف من جسم معدني تحلق في المغناطيس. لذا ، يجب على العاملين الذين يجرون التجارب MR تكون حذرا لإزالة أي أجسام معدنية من ملابسهم قبل الدخول إلى القرب من الصك ، وكذلك الحفاظ على البيئة المحيطة بها خالية من هذه الأجسام. مزيد من المعلومات التفصيلية بشأن السلامة المغناطيس يظهر في الأدب (1) وصفحات الويب التالية : http://www.imrser.org/ . يمكن وجود مواد معدنية لا تتسبب فقط في مسألة السلامة المذكورة أعلاه ولكن تتداخل مع النتائج التجريبية عن طريق حفز التصوير / التحف الطيفية. يمكن تقديم مواد معدنية أو بالقرب من التصوير داخل الكائن تغيير المجال المغناطيسي في منطقة وتولد بذلك على الصور الفنية المكتسبة أو توسيع خط عرض الأطياف.
تبعا لذلك ، وترك المحفظة والمفاتيح والأقلام ، إلخ خارج المغناطيس اذا كنت التعامل مع الحيوانات لإجراءات MR.
جزء 2 : في التصوير بالرنين المغناطيسي فيفو ماوس في مغناطيس اثقب أفقي
تحضير الحيوانات للتصوير بالرنين المغناطيسي
- يجب الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية رعاية الحيوان والمؤسسية لجنة استخدام (IACUC) قبل تنفيذ أي نوع من أنواع التعامل مع الحيوانات.
- استخدام تبخيرها نحن لتخدير الحيوانات isoflurane للتجارب التصوير بالرنين المغناطيسي. لا يمكن أن يتحقق عن طريق تخدير الحيوانات الأخرى مثل التخدير AVERTIN (2،2،2 - TBE أو ثلاثي بروم إيثانول) ومزيج من الكيتامين وزيلازين. تم العثور على المعلومات من جرعة مخدر كل في الجدول 1.
- خط دائرة التعريفي مع لوحة من البلاستيك المدعوم ماصة (الأزرق وسادة أو تشوك). مكان الماوس (أو الفئران متعددة لموضوع الفأر التصوير) في غرفة التعريفي.
- ضبط مقياس الجريان من المرذاذ isoflurane إلى 0.8 1.5 لتر / دقيقة. ثم ضبط المرذاذ isoflurane إلى 4 ٪ لمدة حوالي 3 2.
- بعد بلوغ الطائرة الجراحية للتخدير (أي لم يكن هناك استجابة قرصة أخمص القدمين) ، ضع الماوس على صاحب الحيوان مع أنفها إدراجه ضمن مخروط الأنف (أو قناع). ويمكن استخدام restrainer رئيس للتصوير الرأس ويمكن استخدام حامل الجسم لتصوير الجسم.
- أصحاب الحيوانات تستخدم لمنع الحركة المحتملة : هناك أنواع عدة من أصحاب التجارية. أيضا ، يمكن أن تكون ملفقة حامل مصممة خصيصا لتلبية أية متطلبات خاصة من الإعداد التجريبية. لحامل مصممة خصيصا ، للتأكد من استخدام مواد غير مغنطيسية فقط.
- خلال فترة التصوير ، وضبط مقياس الجريان 0.8 إلى 0.4 مل / دقيقة وتخفيض المرذاذ isoflurane إلى 1.5 ٪ 1.2. يتم جمع غاز منتهية الصلاحية قادمة من الماوس مخروط الأنف بواسطة مضخة وإزالتها الى فراغ في المنزل.
- ستبقى أعين الحيوان رطبة مع مرهم العين التشحيم العقيمة. سيتم الاحتفاظ الحيوان في 35-37 درجة مئوية خلال التجربة ضمن نظام تداول المياه الدافئة. ويمكن استخدام أنواع أخرى من مصدر حرارة مثل منصات ساخنة والهواء الدافئ في مهب في لفائف (RF) الترددات الراديوية.
- نظام مراقبة الحيوانات في المكان لمراقبة درجة حرارة الجسم ، والتنفس / دورة القلب ، والتنفس وتزامن / تبوب القلب مع اقتناء الصور.
- يتم وضع نموذج قياسي مصنوع من agarose بجانب هذا الحيوان لمراقبة التغير المفاجئ الإشارة. هذا النموذج هو معيار آغار مفيدة بشكل خاص لشريحة متعددة ومتعددة في الوقت التصوير نقطة. عندما تم الكشف عن تغيير غير متوقع في إشارة شريحة من الصور المكتسبة ، يمكن القضاء على شريحة مع تغيير إشارة غير متوقعة. أيضا ، يمكن أن تعدل شدة اشارة على أساس تغيير إشارة من العينة القياسية خلال فترة ما بعد تحليل الصور.
- بعد وضع آمن للحيوان ومكونات الرصد على صاحب الحيوان ، موقف صاحب الحيوان في مركز لفائف الترددات اللاسلكية.
- نقل الملف إلى غرفة RF المغناطيس وتضاف لفائف الترددات اللاسلكية في نظام تداول المياه الدافئة وضعت داخل المغناطيس. الشكل 2 يعرض عدة عناصر من ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي لوحظ من الجزء الأمامي من تجويف المغناطيس.
تجربة التصوير بالرنين المغناطيسي
- توليف لفائف الترددات اللاسلكية لتردد صدى H 1 والمباراة المعاوقة المميزة للفائف الى 50 أوم باستخدام لوحة في ضبط الماسح MR. هذا هو تحقيق الظروف المثلى لاستقبال إشارة. ماسحات التصوير بالرنين المغناطيسي معظم البشرية لا تحتاج إلى عملية منفصلة من ضبط / باستثناء مباراةفي إجراءات MRS.
- إجراء عملية الملئ باستخدام سلسلة نبضة واحدة. إشارة MR يعتمد على تجانس المجال المغناطيسي البيئية. عملية الملئ يتيح المجال المغناطيسي في المنطقة التي تهم تكون متجانسة بقدر الإمكان. كل الماسح MR لها طريقتها الخاصة لتنفيذ عملية الملئ ، بما في ذلك العمليات السريعة التلقائي الملئ مثل الخريطة سريع و الملئ التدرج.
- تحسين نبض RF من خلال تعظيم ملف تعريف واحد صورة ثلاثية الأبعاد. يمكن المحتشدة RF نبض القوى مع الحفاظ على طول نبض ثابتة وطويلة بما يكفي TR (تدوير التأخير) التي يتم زهاء 3 -- 5X تي 1 من الأنسجة.
- الحصول على الصور الكشفية على ثلاثة توجهات لإنشاء متعامد المحوري والصور الاكليلية والسهمي. ويمكن استخدام الحصول على الصور بسرعة تسلسل (أي صدى أو التدرج السريع صدى التصوير تسلسل دورة) للحصول على الصور الكشفية. وسيتم استخدام الصور المكتسبة الى خطة للتصوير الفعلي مع عزم طائرات التصوير.
- تغيير تسلسل تدور الصدى. حدد المعلمات التسلسل الصحيح : TR (تدوير تأخير) ينبغي 3-5 أضعاف الأنسجة تي 1 إلى الحصول على صور الاسترخاء التام ، مثل كثافة البروتون أو تي 2 صور مرجح. TE (صدى الوقت) هو المدة الزمنية بين نبضة RF الأولى ومركز إشارة الصدى. يمكن تحديد قيمة TE اعتمادا على النقيض من الصورة ، كما هي ملخصة في الجدول 2. الشكل 2 يظهر في الصور الحية التي يتم الحصول عليها آثار مختلفة من الاسترخاء T 1 و T 2 و T 2 * للماوس عارية مع وجود ورم طعم أجنبي على ظهرها.
- ويمكن القيام T 2 باستخدام القياسات multiecho التصوير أو التصوير صدى واحد مع قيم الشركة المصرية للاتصالات متعددة.
- بعد التجربة MRI / MRS في الجسم الحي ، ينبغي رصد الحيوانات طوال عملية الاسترداد. بعد التصوير بالرنين المغناطيسي ، وسوف تؤخذ هذه الحيوانات من لفائف الترددات اللاسلكية ومراقبتها لضمان الشفاء التام عندما عاد الى القفص. فقدان الحرارة سريعا في تخدير الفئران. الحفاظ على الحيوانات الحار من تغطيتها مع قطع من الشاش أو المناشف و / أو توفير مصدر الحرارة حتى يتم استرداد الحيوانات من التخدير.
معالجة الصور
- اكتسبت استعراض الصور على وحدة MR ونقل البيانات إلى جهاز كمبيوتر المحدد بعد المعالجة.
- نستخدم عادة ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) لتحليل الصور. ويتضمن تحليل الصور حجم الصورة / التصفية ، وحسابات تي 1 ، تي 2 ونشرها ، وقياسات حجم الورم وتجزئة للأورام.
الجزء 3. في فيفو لMRS العضلات Hindlimb ماوس هيكلية في مغناطيس التجويف الرأسي
بناء الكفة لإحداث نقص التروية عكسية
- تبدأ مع قطعة من الأنابيب البلاستيكية التي يتم 5-7 ملم تقريبا واسعة مع معرف من 12-15 ملم. حفر حفرة صغيرة من خلال جدار هذه القطعة والخيط.
- قطع قطعة من البالون ذلك فهو مفتوح على كلا طرفي (بالونات الهيليوم نوعية عمل أفضل). إدراج هذه القطعة من خلال قطعة البلاستيك والتفاف حول العودة وينتهي الشريط معا على الجدار الخارجي للقطعة PVC.
- يتقلص التفاف إلى استخدام الختم البالون تنتهي حول الأنبوب. يجب أن يكون الكفة مع الجدار الخارجي الصلب والجدار الداخلي للنفخ.
- قطع مساحتها تتقلص والتفاف حول الثقب بالون مترابطة ، مع الحرص على ترك الكثير من المواد بين الحفرة وحافة قطعة PVC. الصفحات قطعة الطول 1.5 من معادن غير حديدية (أي النحاس) في حفرة في PVC. هذا يسمح لك لتضخيم الكفة. ختم المنطقة مع الايبوكسي 5 دقائق.
- إصلاح هذه الكفة في المكان المجاور لفائف الترددات اللاسلكية في التحقيق وMRS اتصال الخارجي مقياس ضغط الدم.
مراقب مخصص التنفس
- نستخدم عادة مراقبة التنفس أدلى أن يتم لتكون متوافقة مع مساحة محدودة والوصول إلى تجويف من المغناطيس. هناك عدة نماذج تجارية تتوفر أيضا.
- التعادل بالون صغير إلى نهاية أنابيب مقاومة تمتد إدخالها في التحقيق.
- نعلق على الطرف الآخر من الأنبوب إلى محول الضغط.
- تأكد من أن خط بالون وخالية من فقاعات الهواء. وسوف تخفف من فقاعات الإشارة من ضغط البالون التي تسببها حركة جسم الفأر بسبب التنفس.
دقق في مواضع الماوس MRS
- تخدير والفأر مع آفيرتين 5 ٪ (0.010 من وزن الجسم مل / ز).
- بعد بلوغ الطائرة الجراحية للتخدير ، ضع الماوس في التحقيق MRS بوضع الماوس على ظهرها على دعم الماوس. وضع بالون مملوءة بسائل على الجانب البطني للفأرة وآمنة في مكان مع الأشرطة دعم الماوس.
- الماوس موقف ودعم الهيئة في التحقيق MRS.
- سحب one hindlimb خلال الكفة الدماغية واللولب MRS. وينبغي أن تركز على الساق في لفائف وموالفصل ممكن. ويسمح هذا الترتيب ليكون وضع الجسم الماوس أفقيا في مغناطيس تتحمل العمودي (الشكل 3).
- إصلاح المحطة في مكانها تسجيل القدم لدعم جامدة.
- تحت الجلد في مكان الحرارية hindlimb خارج المنطقة عينات من لفائف.
- ترطيب العين بالعين مرهم التشحيم لمنع العينين من التجفيف. تغطية العينين والوجه الماوس لمنع فرك أو تهيج جدار من التحقيق.
- يمكن إضافة مجسات أخرى للرصد اعتمادا على الاحتياجات المحددة للتجربة.
إعداد تجربة MRS
- ربط تدفق الهواء لعنصر التسخين على التحقيق MRS.
- تعيين وحدة التحكم في درجة الحرارة متغير على البرمجيات VNMR للحفاظ على حرارة المحطة في 35-37 درجة مئوية.
- ضبط التردد والممانعة لفائف المباراة باستخدام لوحة ضبط في البرنامج MRS لكلا H 1 ف 31 والأصداء.
- ضبط الملئ الدوائر لتحسين تجانس الحقل المغناطيسي B1 في المنطقة ذات الاهتمام باستخدام 1 H الطيفي.
- تبديل للتردد ف 31 لتحديد عرض نبضة RF إشارة إلى أقصى عائد من تسوس التعريفي مجانا (FID) (90 درجة مرة).
- إشارة عالية لجمع أطياف الضوضاء استرخاء بالكامل (FRS) لتحديد نسب الفوسفات غير العضوية (ف ط) و فسفوكرياتين (PCR) للبطولة في ظل ظروف مريحة تماما. يتم جمع هذه الأطياف استخدام الوقت 90 درجة مع مرور الوقت بين المقتنيات FID (TR) من 5X تقريبا تي 1 من PCR (20 ثانية. بنسبة 7 ر). وسوف تستخدم هذه الكمي لمستويات ط PCR و ف من الأطياف MR.
تجربة الدماغية
- واضطراب بسيط الدماغية يسمح لتحديد الراحة القصوى وإنتاج ATP الميتوكوندريا من خلال قياس التغيرات في فسفوكرياتين أثناء وفور نقص التروية.
- انشاء مجموعة لجمع أطياف متعددة باستخدام 45 درجة عرض النبضة (أي 0.5 X 90 درجة في الساعة) وTR من 0.5x تي 1 (~ 1.5 ثانية). نجمعها عادة 4 FIDS لكل الأطياف (عدد المتوسط (غير متوفر) = 4 VNMR في مجال البرمجيات) لاستصدار قرار من الوقت ما يقرب من 6 ثوان. هذا القرار ما يكفي من الوقت لتحديد بدقة والراحة القصوى إنتاج ATP الميتوكوندريا.
- جمع أطياف الراحة لمدة 5 دقائق تقريبا.
- حمل ischemia طريق تضخيم الكفة إلى 270-300 مم زئبق لمدة 10-12 دقيقة.
- الافراج عن صفعة وجمع أطياف الانتعاش لمدة 5 دقائق.
- إزالة المسبار من المغناطيس والماوس من التحقيق. السماح للماوس على التعافي من التخدير في ظل الظروف المناسبة. ويمكن تكرار التجارب في الأيام اللاحقة. بعد التجربة النهائية الطيفي عضلات الساق تتم إزالة الماوس وعلى الفور فرضت تجميد N - 2 في السائل لتحليل تركيزات ATP بواسطة HPLC.
تحليل البيانات
- ويتم تحليل البيانات باستخدام حاليا واحدة من عدة برامج التحليل الطيفي لطيف الرنين المغناطيسي النووي. مختبرنا عادة ما يستخدم لتناسب المعايير وjMRUI 2 (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) لقياس المجالات الذروة.
- انهيار أسعار الأولي PCR خلال إقفار هي قياس لإنتاج ATP الميتوكوندريا في ظل ظروف normoxic كما هو موضح في عدة ورقات 3-5. ويمكن استخدام PCR معدلات الاسترداد لتحديد القدرة القصوى للإنتاج ATP الميتوكوندريا بالاستناد إلى النهج الموصوفة سابقا 4،6.
الشكل 1. التصوير بالرنين المغناطيسي في الإعداد فيفو ينظر إليها من الجزء الأمامي من تجويف المغناطيس. الإعداد يتألف من لفائف الترددات اللاسلكية ، ونظام الاحترار الحيوانية (أو نظام التداول الحار الماء) وإدراج التدرج. يتم إدراج جميع هذه المكونات إلى مغناطيس الأفقي. يتم تسخين المياه الدافئة في خزان للمياه خارج الغرفة المغناطيس وإدخالها في نظام الاحترار الحيوانية من خلال أنبوب Tygon (الشريط الأخضر). بعد تداولها في الاسطوانة ، يتم سحبها من نظام المياه الاحترار إلى خزان المياه لتكون ساخنة. يتم استخدام أنبوب isoflurane وفراغ أنبوب لتخدير الفئران خلال التجارب التصوير بالرنين المغناطيسي.
الرقم (2) والصور الحية للماوس عارية مع الورم طعم أجنبي (D282 الورم) على ظهرها (السهم) مع تأثيرات مختلفة الاسترخاء : أ تي 1 زنه صورة (TR / TE = 500/14.2ms). وزن B. T 2 صورة (TR / TE = 2s/40ms). تم الحصول عليها على حد سواء T 1 و T 2 صور مرجحة تسلسل صدى زيادة ونقصان. جيم الخريطة 2 تي المجهزة مع 4 مجموعات من الصور التي حصل عليها DIFferent القيم TE تتراوح 2-80 مللي. D. T 2 * صورة وزنه (TR / TE = 180/7.39ms ، وزاوية الوجه = 20 درجة) التي حصل عليها تسلسل صدى التدرج. مجال الرؤية من 35 ملم 35 × 2 هو لجميع صور الرنين المغناطيسي.
الشكل 3. توضيحات من الماوس المتمركزة في الجسم الأفقي مع صاحب المحطة المضمونين في لفائف الترددات اللاسلكية.
الشكل 4. المجراة أطياف ف 31 عن طريق أحد الإسكيمية دورة ضخه. وقد تم جمع البيانات على المغناطيس 7 T تحمل خط عمودي وسعت مع تصفية الأسي 20 هرتز. يتم رسم TR = 1 ، غ = 4 ، كل الأطياف 20.
الجدول 1. جرعة مخدر للتصوير بالرنين المغناطيسي الماوس / MRS.
| حيوان نوع | مخدر وكيل | جرعة (ملغم / كغم عن طريق الحقن) | مسار |
| فأر | Isoflurane الغاز | 4.0 ٪ لمدة 2-3 دقيقة (التوجيهي) ، ثم 1،2-1،5 ٪ باستمرار (الصيانة) | استنشاقه عن طريق الأنف مخروط |
| فأر | AVERTIN | 5 ٪ من وزن الجسم 10ml/kg | داخل الصفاق (IP) |
| فأر | الكيتامين / زيلازين | 100 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم | الملكية الفكرية |
الجدول 2. صورة مع الأوزان الاسترخاء
| صورة الترجيح | TR (تدوير تأخير) | TE (صدى الوقت) |
| T1 | قصير (أقصر من T1) | قصير (أقصر من T2) |
| T2 | طويل (3 ~ 5 مرات T1) | طويلة (حوالي T2) |
| PD (بروتون الكثافة) | طويل (3 ~ 5 مرات T1) | قصير (أقصر من T2) |
T1 : تدور الاسترخاء شعرية (أو الاسترخاء الطولي) الوقت
T2 : تدور تدور الاسترخاء (استرخاء أو عرضية) الوقت
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات التي تسبق الحصول على توليف / مباراة والملئ حاسمة للحصول على قرار مكانية عالية وعالية إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR). من المهم أيضا لمراقبة ظروف الحيوان مع حيوان نظام الرصد للحفاظ على وجود دولة مستقرة الفسيولوجية للحيوانات خلال الاستحواذ على الامتثال لإشارة التعامل مع الحيوانات وإنسانية لمنع أي احتمال القياسات مصطنعة. يمكن تعديل الإجراءات التي شرحها في بروتوكول للحصول على معلومات إضافية ، بما فيها التصوير ونشرها ، ونضح والتدفق الطيفي المترجمة في الجسم الحي. يجب على جميع الاستعدادات الحيوانية مماثلة ما لم يتم إجراء يتطلب الإعداد التكميلية. وقد تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي وبروتوكولات MRS وصفها في هذه الدراسة عن العديد من التطبيقات بما في ذلك الدراسات الطولية التصوير بالرنين المغناطيسي لتطوير nanoprobes لاستهداف الأورام 7 MRS والدراسات لإنتاج 5،8 ATP الميتوكوندريا. التصوير بالرنين المغناطيسي وسوزان هي تقنيات مفيدة لتصور noninvasively الحيوان تغيير تشريحي الاسترخاء ، أو لمراقبة غير بشكل هدام الأيض. ويمكن استخدام كل التقنيات وإجراءات الرصد طولية لدراسة التغييرات المذكورة أعلاه مع مرور الوقت. لMRS بنينا تحقيق RF المخصصة التي تسمح بالإبقاء على الحيوان في وضع أفقي في مغناطيس تتحمل العمودي. وبالتالي ، يمكن إجراء هذه التجارب على أي المغناطيس واسعة تحمل الرأسية ، مثل وجدت في معظم دوائر الكيمياء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة في جزء من المعاهد الوطنية للصحة / NIBIB R21EB008166 إلى DL وAG028455 NIA NIA وAG022385 لدجم. نشكر الدكتور جيمس اولسون في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان على الفئران لتوفير ورم D282.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inova 200 MR scanner/4.7 T | Varian Inc., Agilent | Used for mouse MRI | |
| Inova 300 NMR spectrometer/7 T | Varian Inc., Agilent | Used for MRS of mouse skeletal muscle |
References
- Stecco, A., Saponaro, A., Carriero, A. Patient safety issues in magnetic resonance imaging: state of the art. Radiol Med. 112, 491-491 (2007).
- Heineman, F. W., Eng, J., Berkowitz, B. A., Balaban, R. S. NMR spectral analysis of kinetic data using natural lineshapes. Magn Reson Med. 13, 490-490 (1990).
- Amara, C. E. Mitochondrial function in vivo: spectroscopy provides window on cellular energetics. Methods. 46, 312-312 (2008).
- Blei, M. L., Conley, K. E., Kushmerick, M. J. Separate measures of ATP utilization and recovery in human skeletal muscle. J Physiol. 465, 203-203 (1993).
- Marcinek, D. J., Schenkman, K. A., Ciesielski, W. A., Conley, K. E. Mitochondrial coupling in vivo in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C457-C457 (2004).
- Paganini, A. T., Foley, J. M., Meyer, R. A. Linear dependence of muscle phosphocreatine kinetics on oxidative capacity. Am J Physiol. 272, 501-501 (1997).
- Sun, C. In vivo MRI detection of gliomas by chlorotoxin-conjugated superparamagnetic nanoprobes. Small. 4, 495-495 (2008).
- Marcinek, D. J. Reduced mitochondrial coupling in vivo alters cellular energetics in aged mouse skeletal muscle. J Physiol. 569, 467-467 (2005).
