非侵襲的インビボでの小動物MRIとMRS：基本的な実験手順

Summary

この作品は、非侵襲的な小動物MRIとMRSの基本的な手順について説明します。

Abstract

小動物磁気共鳴（MR）の研究は、非侵襲的な性質とそれが提供する生物学的情報の豊かさのために現代の生物医学研究の重要な要素として浮上している。 MRはどんな電離放射線を必要とせず、非侵襲的に他の断層や分光学的モダリティと比較してより高い解像度と優れた信号対ノイズ比を提供することができます。このプロトコルでは、我々は非侵襲的に加重リラクゼーションを取得するために小動物のMR画像とMRスペクトロスコピー（MRI / MRS）に焦点を当てる

Protocol

第1部：マグネットの安全性

MRIとMRSの両方は、細心の注意を必要とする強力な磁界を使用してください。例えば、我々は本研究に使用した4.7 Tの装置は、約90,000倍の地球磁場の磁場を持っています。高磁場では、MRスキャナが使用されていない場合でも、常にオンになっています。このような高磁場と接触する金属物が強く、急速に磁石によって魅了される。実験的な主題や演算子が磁石に飛んで金属物体の発射体の経路に配置されている場合、それは非常に危険です。したがって、MR実験を行う者が機器の近接に入る前に衣服からは、金属を除去し、またそのようなオブジェクトからフリー周囲の環境を維持するために注意する必要があります。磁石の安全性についての詳細は文献¹と、以下のウェブページに表示されます。 http://www.imrser.org/~~ROOT~~V 。金属材料の存在は、唯一、前述の安全上の問題を引き起こすが、画像/分光アーティファクトを誘導することにより、実験結果に影響を与えることはありえません。イメージングオブジェクトの近くまたは内部の金属材料の存在は、周辺に磁場を変化させ、その取得した画像上のアーチファクトを生成したり、スペクトルの線幅を広げることができます。

あなたがMRの手続きのために動物を扱う場合に応じて、磁石の外側に財布、鍵、ペン、等を残す。

パート2：マウスの in vivo MRI で水平ボアマグネットの

MRIのための動物の準備

1. すべての動物の手順は、動物取扱のいずれかのタイプを実行する前に制度的な動物のケアと使用委員会（IACUC）によって承認されるべきである。
2. 我々はMRI実験のために動物を麻酔イソフルラン気化使用。動物の麻酔は、AVERTIN（2,2,2 - トリブロムエタノールまたはTBE）とケタミンとキシラジンのカクテルなど、他の麻酔薬によって達成することができます。各麻酔薬の投与量の情報を表1に含まれています。
3. プラスチック製のバックアップ吸収パッド（ブルーパッドまたはチャック）とライン誘導室。誘導チャンバ内でマウスを（または複数のマウスのイメージングのための複数のマウス）に置きます。
4. 0.8から1.5 L / minにイソフルラン気化器の流量を調整します。その後、約2 3分間、4％にイソフルラン気化器を調整する。
5. 麻酔の外科的平面（つまり、つま先のピンチの応答を）に達した後、ノーズコーン（またはマスク）に挿入し、その鼻と動物のホルダーの上にマウスを置きます。ヘッド制止する人は、体のイメージングに使用することができる頭のイメージングとボディのホルダーに使用することができます。
6. 動物の所有者は、潜在的な運動を防止するために使用されています：商業権者のいくつかのタイプがあります。また、カスタム設計されたホルダーは、実験装置の特別な要件に対応するために製造することができる。カスタム設計されたホルダーの場合、唯一の非磁性材料を使用してください。
7. イメージング期間中に、0.4 0.8 mL / minに流量計を調整し、1.2〜1.5％イソフルレン気化器を削減する。マウスのノーズコーンからの呼気ガスは、ポンプによって収集され、社内での真空中に削除されます。
8. 動物の眼は、無菌の目の潤滑の軟膏と湿った保たれます。動物は、暖かい水循環システム内で実験中に35〜37 ° Cで保管いたします。熱源の他のタイプは、加熱されたパッドと高周波（RF）コイルに吹き込まれる暖かい空気として使用することができます。
9. 動物のモニタリングシステムは、体温、呼吸/心周期を監視し、画像取得と呼吸/心臓ゲーティングを同期させるところにあります。
10. アガロース製の標準サンプルは、急激な信号変化を監視するために動物の隣に配置されます。この標準寒天サンプルは、マルチスライス、マルチタイムポイントイメージングのために特に有用である。予期しない信号変化が得られた画像からスライスで検出されると、予期しないシグナルの変化を持つスライスを解消することができる。また、その信号強度は、後の画像の分析時に標準サンプルの信号の変化に基づいて調整することができます。
11. しっかりと動物の所有者に動物と監視コンポーネントを配置した後、RFコイルの中心に動物のホルダーを配置します。
12. 磁石の部屋にRFコイルを移動し、磁石の中に置かれた暖かい水の循環システムにRFコイルを挿入する。図2は、磁石の正面から見たMRIスキャナのいくつかのコンポーネントは、ボアが表示されます。

MRI実験

1. ¹ Hの共鳴周波数にRFコイルをチューニングし、MRスキャナでチューニングパネルを使用して50オームにコイルの特性インピーダンスと一致している。これは、信号受信の最適な条件を達成することです。ほとんどの人間のMRIスキャナは除くチューン/マッチの別のプロセスを必要としないMRSを切り離してください。
2. 単一のパルスシーケンスを用いてシミング処理を行う。 MR信号は、環境磁界の均一性に依存しています。シミングプロセスはできるだけ均質に関心のある領域で磁場を有効にします。各MRスキャナは、高速のマップと勾配のシミングなどの自動高速シミングプロセスを含むシミングプロセスを、実行する独自の方法があります。
3. 一次元画像のプロファイルを最大化することで、RFパルスを最適化します。組織の5倍T ₁ -定数と約3か十分に長いTR（リサイクル遅延）パルスの長さを維持しながらRFパルスパワーを配列することができます。
4. アキシャル、コロナル、矢状イメージを作成する3つの直交方向に沿って画像を偵察取得する。高速の画像取得のシーケンス（すなわち勾配エコーや高速スピンエコー撮像シーケンスは）スカウトの画像を取得するために使用することができます。取り込んだ画像は、撮像面の決定と実際の撮影のために計画するために使用されます。
5. エコーシーケンスをスピンに変更します。適切な順序でパラメータを選択：TR（リサイクル遅延）は、プロトン密度またはT ₂強調画像として完全にリラックスした画像を取得するためにT ₁ 3〜5倍の組織でなければなりません。 TE（エコー時間）は最初のRFパルスとエコー信号の中心間の時間です。 TEの値を表2に示すように、画像のコントラストに応じて選択することができます。その背中に異種移植腫瘍を持つヌードマウスのT _{1、T 2}及びT ₂ *の異なる緩和の効果を取得した生体画像で図2に示す。
6. T ₂の測定は、どちらマルチエコーイメージングまたは複数のTEの値を持つシングルエコーイメージング法を用いて行うことができます。
7. in vivoでのMRI / MRSの実験に続いて、動物は回復プロセス全体を監視する必要があります。 MRイメージング後、動物は、RFコイルから取り出され、ケージに戻されたときに完全復旧を確実に監視されます。熱損失は、麻酔したマウスでは急速です。動物が麻酔から回復されるまで、ガーゼパッドやタオルでそれらをカバーする、および/または熱源を提供することにより、動物が冷えないように保管してください。

画像処理

1. レビューは、MRのコンソール上で画像を取得し、後処理のコンピュータに選択したデータを転送する。
2. 我々は通常、ImageJは（使用http://rsbweb.nih.gov/ij/を画像を分析するため）。画像解析は、画像のスケーリング/フィルタリング、T _{1、T 2}と拡散の計算は、腫瘍体積の測定値と腫瘍のセグメンテーションが含まれています。

第3部。垂直ボアマグネットのマウス後肢骨格筋のin vivo MRSで

可逆的虚血を誘発するためのカフの構築

1. 12〜15ミリメートルのidを持つ幅約5〜7ミリメートルである塩ビ管の部分から始めます。この作品とスレッドの壁を通して小さな穴をあけます。
2. それは両端（ヘリウムの品質のバルーンが最高の仕事）で開いているので、バルーンの部分をカット。バックの周りPVCピースとラップを介してこの部分を挿入し、テープには、PVCの部分の外側の壁に一緒に終了します。
3. バルーンは、管の周囲に終わるシールするために収縮ラップを使用してください。あなたは、固体の外壁と膨らませて内壁とのカフを持つ必要があります。
4. 穴とPVCピースのエッジ間の材料の多くを残すように注意しながら、ネジ穴周りのシュリンクラップとバルーンの領域を切り抜きます。 PVCの穴に非鉄金属（すなわち黄銅）の1.5cmの部分を通します。これは、カフを膨らませることができる。 5分エポキシで領域を密封する。
5. MRSのプローブでRFコイルの横の場所にこのカフを修正し、外部の血圧計に接続します。

カスタム呼吸モニタ

1. 私たちは、制限された空間と磁石のボアへのアクセスと互換性を持つように作られるカスタムメイドの呼吸モニタを使用してください。いくつかの市販モデルもご用意しております。
2. プローブに供給ストレッチ耐熱チューブの端に小さなバルーンを結ぶ。
3. 圧力トランスデューサーへのチューブのもう一方の端を取り付けます。
4. ラインとバルーンは空気の気泡がないか確認してください。気泡は、呼吸によるマウスの体の動きによって引き起こされるバルーンの圧迫からの信号を減​​衰させます。

MRSプローブでマウスのポジショニング

1. 5パーセントAVERTIN（0.010ミリリットル/ g体重）をマウスに麻酔。
2. 麻酔の外科平面に到達した後、マウスのサポートに背の上にマウスを置くことによって、MRSのプローブにマウスを合わせます。マウスの腹側に液体で満たされた風船を置き、マウスのサポートストラップで固定固定します。
3. MRSのプローブの位置のマウスと本体のサポート。
4. 虚血性カフとMRSのコイルを介して1つの後肢を引き出します。脚部は、muとコイルの中央に配置されるべきであるできるだけCH。この配置は、マウス本体が垂直ボアマグネット（図3）に水平に配置することができます。
5. リジッドサポートに足をテープで場所に足を固定してください。
6. コイルによってサンプリングされた領域の外側の後肢皮下に熱電対を置きます。
7. 乾燥から目を防ぐために、眼の潤滑軟膏で目を湿らせ。マウスの目をカバーし、プローブの壁から摩擦や炎症を防止するために直面​​している。
8. 他の監視プローブは、実験の具体的なニーズに応じて追加することができます。

MRSの実験のセットアップ

1. MRSのプローブに発熱体への空気の流れを接続します。
2. 35から37で足の温度を維持するためにVNMRソフトウェアで可変温度制御ユニット℃を設定する
3. コイルの周波数及び¹ Hおよび³¹ P共鳴の両方のためのMRSのソフトウェアでチューニングパネルを使用して一致インピーダンスを調整する。
4. ¹ H分光法を用いて関心領域でB1磁場の均一性を最適化するためにシム回路を調整します。
5. つの空き誘導減衰（FID）（90 °時）から最大の信号を生成するために、RFのパルス幅を決定するために³¹ Pの周波数に切り替えます。
6. 完全にリラックス条件下でATPに無機リン酸の比率（P _i）とクレアチンリン酸（PCR）を決定するためにノイズを完全にリラックスしたスペクトル（FRS）に高信号を収集する。これらのスペクトルは、PCRのT _1が （20秒7 Tで）約5倍のFIDの買収との間の時間（TR）と90 °の時間を使って収集されます。これらは、MRスペクトルからPCRとP _iのレベルの定量に使用されます。

虚血実験

1. シンプルな虚血性摂動が中にクレアチンリン酸の変化を測定することにより、安静時および最大ミトコンドリアATP産生の測定とその直後の虚血することができます。
2. 45 °パルスの幅（すなわち、0.5 × 90 °の時）と0.5倍のTR T _1（〜1.5秒。）を使用して複数のスペクトルを収集するようにセットアップ配列。我々は一般的に約6秒の時間分解能のためのすべてのスペクトル（VNMRソフトウェアの平均の数（NA）= 4）4 FIDが収集する。この時間分解能は、正確に安静時と最大ミトコンドリアATPの生産を決定するのに十分です。
3. 約5分間の休憩のスペクトルを収集する。
4. 10-12分のために270から300 mmHgにカフを膨らませて虚血を誘発する。
5. カフを解放し、5分間の回復のスペクトルを収集する。
6. プローブから磁石とマウスからプローブを削除します。マウスは、適切な条件下で麻酔から回復することができます。実験は、その後の日に繰り返すことができます。最終的な分光実験のマウスの足の筋肉は、次のHPLCによるATP濃度の分析のために液体_窒素で除去し、直ちに凍結クランプされています。

データ解析

1. データは、NMRスペクトルにはいくつかのスペクトル解析プログラムのいずれかを使用してオフラインで分析されます。当研究室では、通常、ピーク面積を定量化するための標準的な²とjMRUI（http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml）に適合しています。
2. 虚血時の最初のPCRの破壊率は、いくつかの論文^3-5で説明したように正常酸素条件下ではミトコンドリアのATP産生の指標である。 PCR回収率は、以前は次の^4,6で説明したアプローチに基づいて、ミトコンドリアATP産生のための最大限の能力を決定するために使用することができます。

図1は、。磁石の前面から見た生体MRIセットアップではボア。セットアップは、RFコイル、動物の加温システム（または温水循環システム）と勾配のインサートで構成されています。すべてのこれらのコンポーネントは水平方向の磁石に挿入されます。暖かい水は磁石の部屋の外に水のタンクに加熱し、タイゴンチューブ（緑テープ）を介して動物の温暖化のシステムに導入される。シリンダー内を循環した後、水が加熱される水のタンクに戻す加温システムから取得されます。イソフルラン管と真空管は、MRI実験中にマウスを麻酔するために使用されます。

図2さまざまなリラクゼーション効果と、その後ろ（矢印）上に異種移植腫瘍（D282腫瘍）とヌードマウスのin vivo画像では：。A. T ₁の画像を（TR / TE = 500/14.2ms）重量を量った。 B. T _2は、画像（TR / TE = 2s/40ms）を圧迫した。 T ₁とT ₂強調画像の両方は、スピンエコーシーケンスに買収された。 C. T _2のマップは、DIFによって取得された画像の4セットで処理20〜80ミリまでferent TEの値。 D. T ₂グラディエントエコーシーケンスで取得した*計量した画像（TR / TE = 180/7.39ms、フリップ角= 20度）。 35 × 35 mm ²のビューのフィールドには、すべてのMR画像用です。

図3脚で水平方向の体のホルダー内に配置マウスのイラストは、RFコイル内に固定。

図4。生体³¹ Pスペクトルの1つの虚血再灌流サイクルを通じた。データは、20 Hzの指数フィルタを広げ7 T垂直ボア磁石とラインで採取された。 TR = 1、NA = 4、すべての20スペクトルがプロットされます。

表1。マウスMRI / MRSのための麻酔薬の投与量。

動物 種	麻酔薬 エージェント	投与 （注射用mg / kg体重）	ルート
マウス	イソフルランガス	その後2〜3分（誘導）は4.0％、1.2〜1.5パーセント連続して（メンテナンス）	ノーズコーンを介して吸入
マウス	AVERTIN	5％、10ml/kg体重	腹腔内（IP）
マウス	ケタミン/キシラジン	は100 mg / kg及び10 mg / kgの	IP

表2。リラクゼーションの重み付けによる画像

画像の重み付け	TR（リサイクル遅延）	TE（エコー時間）
T1	ショート（T1より短い）	ショート（T2より短い）
T2	ロング（3〜5倍T1）	ロング（T2前後）
PD（陽子密度）	ロング（3〜5倍T1）	ショート（T2よりも短い）

T1：スピン格子緩和（または縦緩和）時間
T2：スピンスピン緩和（または横緩和）時間

Discussion

チューン/マッチとシムの買収前の手順では、高い空間分解能と高い信号対雑音比（SNR）を取得するために重要です。それは人道的な動物の取扱いに準拠すると共に、潜在的な人工の測定を防ぐために、信号の集録中に動物のための安定した生理状態を維持するために動物の監視システムで動物の状態を監視することも重要です。プロトコルで説明される手順は、拡散、灌流、フローイメージングと生体内でのローカライズされた分光法を含む追加情報を取得するように変更することができます。手順は補足のセットアップを必要としない限り、すべての動物の準備は同じようになります。本研究で説明されているMRIとMRSのプロトコルは、ミトコンドリアATP産生^5,8のために腫瘍⁷とMRSの研究を対象とするナノプローブの開発のための縦方向MRIの研究を含むいくつかのアプリケーションに使用されている。 MRIとMRSは、非侵襲的に動物の解剖学的、リラクゼーションの変化を視覚化するか、非破壊で代謝を監視するために有用なテクニックです。両方の技術は時間をかけて上記の変化を調べるために長手方向の監視手順として使用することができます。 MRSのために私たちは動物が垂直ボア磁石の水平位置で維持できるようにするカスタムのRFプローブを構築。従って、これらの実験は、ほとんどの化学部門で見られるような、あらゆる垂直ワイドボアマグネットで行うことができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T	Varian Inc., Agilent		Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T	Varian Inc., Agilent		Used for MRS of mouse skeletal muscle