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Biology

비침 투 VIVO에서 스몰 애니멀 MRI 및 MRS : 기본 실험 절차

Published: October 20, 2009 doi: 10.3791/1592
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Radiology, University of Washington, 2Department of Bioengineering, University of Washington

Summary

이 작품은 비침 투 작은 동물 MRI 및 MRS의 기본 절차를 설명합니다

Abstract

작은 동물 자기 공명 (MR) 연구는 비침습 자연과 그것이 제공하는 생물 학적 정보의 풍부에 의해 현대 생물 의학 연구의 중요한 요소로 떠오르고있다. MR은 이온화 방사선을 필요로하지 않으며 noninvasively 다른 단층 또는 spectroscopic modalities에 비해 높은 해상도와 더 나은 신호 대 잡음 비율을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 noninvasively 휴식이 가중 취득 작은 동물 MR 영상 및 MR 분광법 (MRI / MRS)에 초점을 맞출 것이다

Protocol

1 부 : 자석 안전

MRI 및 MRS 모두 극도로주의를 요구하는 강력한 자기장을 사용합니다. 예를 들어, 우리가 현재 작업에 사용했던 4.7 T 악기는 약 90,000 배 지구 자기장에게 자기장을 가지고있다. 높은 자기장은 MR 스캐너가 사용되지 않는 경우에도 항상 있습니다. 이러한 높은 자기장과 접촉에 와서 모든 금속 물체는 강력하고 빠르게 자석에 의해 매력을 것입니다. 실험 제목이나 연산자가 자석으로 비행 금속 물체의 발사 경로에있는 경우는 매우 위험합니다. 따라서, MR 실험을 수행 인원은 악기의 근접에 들어가기 전에 자신의 의복에서 어떤 금속 물체를 제거하고 또한 개체에서 무료로 주변 환경을 유지하기 위해 신중해야합니다. 자석 안전에 대한 더 자세한 정보는 문학 1 다음 웹페이지에 나타납니다 http://www.imrser.org/ . 금속 재료의 존재는 상기 안전 문제를 일으킬하지만 영상 / spectroscopic 유물을 유도하여 실험 결과에 영향을 수 없습니다. 이미징 객체 근처 또는 내부 금속 재료 선물은 근처에 자기장을 변경하고 그래서 얻은 이미지 유물을 생성하거나 스펙트럼의 라인 너비를 확장 할 수 있습니다.

당신은 MR 절차에 대한 동물을 처리하는 경우 따라서, 자석 외부 지갑, 열쇠, 펜, 등등 두십시오.

2 부 : 마우스의 생체내 MRI에서는 수평 보어 자석에

MRI에 대한 동물의 준비

  1. 모든 동물의 절차는 동물 취급의 종류를 실행하기 전에 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받아야한다.
  2. 우리는 MRI 실험 동물을 마취하는 isoflurane 증발 사용합니다. 동물의 마취는 그러한 avertin (2,2,2 - tribromoethanol 또는 TBE)와 마취제와 xylazine의 칵테일과 같은 다른 anesthetics에 의해 얻을 수 있습니다. 각 마취의 투여량 정보는 표 1에서 발견된다.
  3. 플라스틱 백업 흡수 패드 (블루 패드 또는 척)과 일치 유도 챔버. 유도 챔버에 마우스 (또는 멀티 마우스 이미지에 대해 여러 쥐) 장소.
  4. 0.8 1.5 L / 분에 isoflurane 기화기의 유량계를 조정합니다. 다음 isoflurane 기화기 2 약 3 분 4 %로 조정합니다.
  5. 마취의 수술 비행기 (예 : 없음 발가락 핀치 응답)에 도달하면, 코 콘 (또는 마스크)에 삽입의 코를 가진 동물 소유자에 마우스를 놓으십시오. 머리 restrainer는 머리 이미징에 사용할 수 있으며 신체 소유자는 신체 이미지에 사용할 수 있습니다.
  6. 동물의 소유자는 잠재적인 움직임을 방지하기 위해 사용됩니다 : 상업 소유자의 몇 가지 종류가 있습니다. 또한, 사용자 정의 설계 보유자는 실험 설정의 특별한 요구 사항을 수용하기 위해 조작하실 수 있습니다. 사용자 정의 설계 홀더 들어, nonmagnetic 자료를 사용할 수 있는지 확인하십시오.
  7. 이미징 기간 동안 0.4 0.8 ML / 분에 유량계를 조절하고 1.2 1.5 % isoflurane 기화기을 줄일 수 있습니다. 마우스 코 콘에서 오는 만료 가스 펌프 수집하여 내부 진공으로 제거됩니다.
  8. 동물의 눈은 살균 안과 윤활 연고와 젖은 유지됩니다. 동물은 온수 순환 시스템 내에서 실험 기간 동안 35-37 ° C에 보관됩니다. 열원의 다른 종류의 같은 온수 패드와 radiofrequency (RF) 코일에 날려 온풍으로 사용할 수 있습니다.
  9. 동물 모니터링 시스템은 체온, 호흡 / 심장 사이클을 모니터하고, 이미지 인수와 함께 호흡 / 심장 게이팅를 동기화하는 장소이다.
  10. 아가로 오스로 만든 표준 샘플 돌발 신호의 변화를 모니터링하는 동물 옆에 배치됩니다. 이 표준 한천 샘플은 다중 슬라이스와 멀티 포인트 화상 시간에 특히 유용합니다. 예상치 못한 신호 변화가 취득한 이미지 통에 감지되면, 예기치 않은 신호 변화와 슬라이스은 멸망하게 될 수 있습니다. 또한, 그 신호 강도는 포스트 - 이미지 분석시 표준 시료의 신호 변화에 따라 조정할 수 있습니다.
  11. 안전하게 동물 소유자에 대한 동물 및 모니터링 구성 요소를 배치 후, RF 코​​일의 중심에있는 동물 홀더를 위치.
  12. 자석 룸에 RF 코​​일을 이동하며 자석 안에 온수 순환 시스템에 RF 코​​일을 삽입합니다. 그림 2는 자석의 전면에서 관찰된 MRI 스캐너의 여러 구성 요소가 보어가 표시됩니다.

MRI 실험

  1. 1 H의 공진 주파수에 RF 코일을 조정하고 MR 스캐너에있는 조정 패널을 사용하는 50 옴에 코일의 특성 임피던스를 일치합니다. 이것은 신호 수신의 최적 조건을 달성하는 것입니다. 대부분의 인간의 MRI 스캐너를 제외하고 조정 / 일치하는 별도의 과정을 요구하지 않습니다MRS 절차 인치
  2. 단일 펄스 시퀀스를 사용하여 shimming 과정을 실시합니다. MR 신호는 환경 자기장의 균질성에 의존합니다. shimming 과정은 최대한 균질로 관심의 영역에서 자기장을 수 있습니다. 각 MR 스캐너는 빠른지도와 기울기 shimming 같은 자동 shimming 빠른 프로세스를 포함하여 shimming 프로세스를 수행하기 위해 자신의 방법이 있습니다.
  3. 1 차원 이미지 프로필을 극대화하여 RF 펄스을 최적화합니다. 조직의 T 1 5 배 - 펄스 길이가 일정하고 약 3 충분히 TR (재활용 지연) 유지하면서 RF 펄스 파워는 못하였 느니라 수 있습니다.
  4. 축, 코로나와 화살 이미지를 만드는 세 가지 직교 방향을 따라 이미지를 스카우트 취득. 빠른 이미지 수집 시퀀스 (즉, 기울기 반향이나 빠른 스핀 에코 영상 순서) 스카우트 이미지를 획득하는 데 사용할 수 있습니다. 구입한 이미지는 이미지 비행기의 결정과 실제 영상을 위해 계획하는 데 사용됩니다.
  5. 에코 순서를 스핀​​로 변경합니다. 적절한 순서 매개 변수를 선택합니다 : TR (재활용 지연)은 3-5 번 T 1과 같은 프로톤 밀도 또는 T이 가중 이미지로 완벽하게 편안한 이미지를 얻기위한 조직해야합니다. TE (에코 시간) 최초의 RF 펄스와 반향 신호의 중심 사이의 시간 기간입니다. TE 값은 표 2에 요약으로 이미지 명암에 따라 선택할 수 있습니다. 그 뒤쪽에 이종 이식 종양이있는 누드 마우스에 대한 T 1, T 2, T 2 *의 다른 휴식 효과를 인수 생체내 이미지 그림 2 보여줍니다.
  6. T이 성능은 어느 multiecho 이미징 또는 여러 TE 값을 단일 에코 이미징을 사용하여 수행할 수 있습니다.
  7. 생체내에 MRI / MRS 실험 이후에, 동물은 복구 프로세스 전반에 걸쳐 모니터링해야합니다. MR 이미징 후, 동물은 RF 코​​일 밖으로 촬영하고 창구로 돌아왔을 때 완전한 복구를 보장하기 위해 모니터링됩니다. 열 손실 anesthetized 생쥐에서 빠른 속도입니다. 거즈 패드 또는 수건 및 / 그들을 덮고이나 동물이 마취에서 회복되기 전까지는 열원을 제공하여 동물 보온.

이미지 처리

  1. 검토 MR 콘솔에서 이미지를 획득하고 후처리 컴퓨터에 선택한 데이터를 전송.
  2. 우리는 일반적으로 ImageJ (사용 http://rsbweb.nih.gov/ij/를 이미지 분석). 이미지 분석 이미지 스케일링 / 필터링, T 1, T 2, 확산의 계산, 종양 부피 측정과 종양의 세분화를 포함합니다.

부 3. 수직 보어 자석에 마우스 Hindlimb 골격근에 대한 VIVO MRS에서

가역 국소 빈혈을 유도를위한 커프 구축

  1. 12~15밀리미터의 ID로 다양한 약 5~7mm입니다 PVC 파이프 조각으로 시작합니다. 이 조각 및 스레드의 벽을 통해 작은 구멍을 드릴.
  2. 그것이 (헬륨 풍선의 품질이 최고의 작품) 양쪽에 열려 있으므로 풍선의 한 조각을 잘라 버릴거야. PVC 조각을 통해 조각을 삽입하고 주변을 다시 포장 및 테이프는 PVC 조각의 외부 벽에 함께 끝납니다.
  3. 풍선을 봉인하기 위해 포장을 축소 사용 튜브 주위에 끝납니다. 당신은 단단한 외벽과 내벽 팽창과 커프스 버튼이 있어야합니다.
  4. 구멍과 PVC 조각의 가장자리 사이의 물질을 충분히 떠날 간병, 스레드 구멍 주위 수축 포장과 풍선의 영역을 잘라 버릴거야. PVC에있는 구멍에 비철금속 금속 (예 : 황동)의 1.5 cm 기사를 스레드. 이것은 수갑 급증 수 있습니다. 5 분 에폭시와 함께 그 지역을 봉쇄하라.
  5. MRS 프로브의 RF 코​​일 옆에 자리에서 수갑 수정하고 외부 혈압계에 연결합니다.

정의 호흡 모니터

  1. 우리는 제한된 공간과 자석의 구멍에 액세스할 수있는 호환되도록 만들어 사용자 정의 만든 호흡 모니터를 사용합니다. 몇몇 상업적인 모델도 있습니다.
  2. 프로브에 공급 스트레치 방지 튜브의 끝 부분에 작은 풍선을 묶어.
  3. 압력 변환기로 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다.
  4. 라인과 풍선 기포가 무료입니다하셔야합니다. 거품은 호흡에 의한 마우스 본체의 움직임에 의한 풍선의 압축에서 신호를 감쇠합니다.

MRS 프로브의 마우스 위치

  1. 5% Avertin (0.010 ML / G 체중)와 마우스를 마취.
  2. 마취의 수술 비행기에 도달 후, 마우스 지원에의 뒷면에있는 마우스를 배치하여 MRS 프로브에 마우스를 위치. 마우스의 복부 측면에있는 유체 - 채워진 풍선을 플레이스와 마우스 지원 스트랩과 장소에서 보안.
  3. 위치 마우스 및 MRS 프로브의 신체 지원합니다.
  4. 허혈성 수갑을 채워 부인 코일을 관통 hindlimb을 당기세요. 다리가 만무로 코일 중심되어야가능한 채널. 이 배열은 마우스 본체는 (그림 3) 수직 구멍 자석 수평으로 위치 수 있습니다.
  5. 강성 지원하는 다리를 녹화하여 자리에 다리를 수정.
  6. 코일에 의해 샘플이 지역 이외의 hindlimb의 subcutaneously 열전대를 배치합니다.
  7. 건조에서 눈을 방지하기 위해 안과 윤활 연고와 눈을 축축하게하다. 마우스 눈을 감아라과 프로브의 벽에서 마찰이나 자극을 방지하기 위해 얼굴.
  8. 기타 모니터링 프로브는 실험의 구체적인 필요에 따라 추가할 수 있습니다.

부인 실험 설정

  1. MRS 프로브에서 가열 요소에 공기 흐름을 연결합니다.
  2. 35-37에서 다리의 온도를 유지하기 위해 VNMR 소프트웨어 변수 온도 제어 장치 ° C.를 설정
  3. 코일 주파수 및 1 H 31 P의 resonances 모두 부인 소프트웨어의 튜닝 패널을 사용하여 일치하는 임피던스 조정.
  4. 1 H 분광법을 사용하여 관심있는 지역에서 B1 자기장의 균질성을 최적화하는 회로를 shimming 조정합니다.
  5. 하나가 공짜 유도 붕괴 (FID) (90 시간)에서 최대의 신호를 얻을 수있는 RF 펄스 폭을 결정하는 31 P 주파수로 전환합니다.
  6. 완전히 편안한 조건에서 ATP로 무기 인산염의 비율 (P I) 및 phosphocreatine (PCR)을 결정하는 소음이 완벽하게 편안한 스펙트럼 (FRS)에 높은 신호를 수집합니다. 이러한 스펙트럼은의 FID의 인수 사이의 시간 (TR)과 함께 90 시간을 사용하여 수집됩니다 약 5 배 PCR의 T 1 (20 초. 7 T). 이들은 MR 스펙트럼에서 PCR과 P I 수준의 부량 사용됩니다.

허혈성 실험

  1. 간단한 허혈성 섭동는 동안 phosphocreatine의 변화를 측정하여 휴식과 최대한의 mitochondrial ATP 생산의 결정을 허용하고 즉시 국소 빈혈에 따라.
  2. 45를 사용하여 여러 스펙트럼을 수집하는 설정 배열 ° 펄스 폭 (즉, 0.5 X 90 시간) 및 0.5x의 TR T 1 (~ 1.5 초).. 우리는 일반적으로 약 6 초 시간 분해능의 모든 스펙트럼 (VNMR 소프트웨어에 평균 수 (나) = 4) 4 FIDs를 수집합니다. 이번에는 해상도는 정확하게 휴식하고 최대한 mitochondrial ATP 생산을 결정하기 위해 충분하다.
  3. 약 5 분 쉬고 스펙트럼를 수집합니다.
  4. 10-12분 위해 270-300 mmHg로 수갑 찬하여 국소 빈혈을 유발.
  5. 수갑 풀어 5 분 복구 스펙트럼을 수집합니다.
  6. 프로브에서 자석과 마우스에서 프로브를 제거합니다. 마우스가 적절한 조건 하에서 마취에서 회복하도록 허용합니다. 실험 이후 일 반복 수 있습니다. 최종 분광 실험 마우스 다리 근육에 따라 HPLC에 의해 ATP의 농도의 분석을 위해 액체 N 2에서 제거하고 즉시 냉동 고정되어 있습니다.

데이터 분석

  1. 데이터는 NMR 스펙트럼에 대한 몇 가지 스펙트럼 분석 프로그램 중 하나를 사용하여 오프라인 분석이다. 저희 연구실은 일반적으로 정상 부분을 quantifying에 대한 표준 2 jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml)에 맞게 사용합니다.
  2. 3-5 여러 신문에 설명된대로 국소 빈혈 동안 초기 PCR 분석 요금은 normoxic 조건 mitochondrial ATP 생산의 척도입니다. PCR 회복 속도는 이전에 다음 ID로 4,6 설명한 방식에 따라 mitochondrial ATP 생산을위한 최대한의 용량을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 자석의 전면에서 볼 생체내 MRI 설정에서 낳았다. 설치 RF 코​​일, 동물 온난 화 시스템 (또는 온수 순환 시스템) 및 기울기 삽입으로 구성됩니다. 이러한 모든 구성 요소는 수평으로 자석에 삽입됩니다. 따뜻한 물이 자석 룸 밖의 물이 저수지에서 가열하고 Tygon 튜브 (녹색 테이프)를 통해 동물의 온난 화 시스템에 도입입니다. 실린더의 순환 후, 물을 가열하는 물이 저수지로 다시 온난 화 시스템에서 가져온 것입니다. isoflurane 관과 진공관이 MRI 실험하는 동안 마우스를 마취하는 데 사용됩니다.

그림 2
그림 2 다양한 휴식 효과와의 뒤로 (화살표)에 이종 이식 종양 (D282 종양)와 누드 마우스에 대한 생체내 이미지 :. A. T 1 이미지 (TR / TE = 500/14.2ms) 정도. B. T 2 이미지 (TR / TE = 2s/40ms) 정도. 모두 T 1과 T 2 가중 이미지는 스핀 에코 시퀀스에 인수되었다. C. T이지도 DIF 인수 이미지를 4 세트로 처리20 일부터 80 MS에 이르기까지 ferent TE 값. D. T 2 * 무게 이미지 (TR / TE = 180/7.39ms, 플립 각도 = 20도)는 기울기 에코 시퀀스에 인수. 35 X 35mm 2 볼 분야는 모든 MR 이미지입니다.

그림 3
그림 3. 다리와 수평 신체 홀더에 위치하고 마우스의 그림은 RF 코일의 확보.

그림 4
그림 4. 생체내 31 P 스펙트럼 사람들을 국소 빈혈 reperfusion의 사이클을 통해. 데이터는 20 Hz에서 기하 급수 필터로 확대 7 T 수직 구멍 자석과 온라인에서 수집되었다. TR = 1, 나 = 4, 매 20 스펙트럼을 꾸몄다 있습니다.

표 1. 마우스 MRI / MRS를위한 마취의 투약.

동물
종 		마취제
대리인 		복용량
(MG / injectables에 대한 ㎏) 		노선
마우스 Isoflurane 가스 2-3 분 (유도)의 4.0 %, 지속적으로 다음 1.2-1.5 % (유지 보수) 코 콘을 통해 흡입
마우스 Avertin 5 %, 10ml/kg 체중 intraperitoneal (IP)
마우스 케타민을 / Xylazine 100 MG / kg, 10 MG / kg IP


표 2. 휴식 weightings와 이미지

이미지 가중치 TR (재활용 지연) TE (에코 시간)
T1 단편 (T1 미만) 단편 (T2 미만)
T2 길이 (3 ~ 5 회 T1) 롱 (T2 정도)
PD (양성자 밀도) 길이 (3 ~ 5 회 T1) 단편 (T2 미만)

T1 : 스핀 격자 완화 (또는 세로 휴식) 시간
T2 : 스핀 스핀 휴식 (또는 가로 휴식) 시간

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Discussion

튜닝 / 일치와 shimming의 사전 취득 단계 높은 공간 해상도와 높은 신호 대 잡음 비율 (SNR)를 취득하기 위해 중요합니다. 인간 동물 취급을 준수하고 모든 잠재적인 artifactual 측정을 방지하기 위해 신호 인수하는 동안 동물에 대한 안정적인 생리 상태를 유지하기 위해 동물의 모니터링 시스템과 동물 조건을 모니터링하는 것도 중요합니다. 프로토콜에서 설명한 절차가 확산, 관류 및 흐름 이미징 및 생체내에서 현지 분광법을 포함하여 추가 정보를 얻기 수정할 수 있습니다. 절차 보충 설정을 필요로하지 않는 모든 동물 준비가 비슷합니다. 이 연구에서 설명된 MRI 및 MRS의 프로토콜은 mitochondrial ATP 생산을 5,8에 대한 종양 7 MRS 연구를 대상으로 나노 프로브의 개발을위한 종방향 MRI 연구를 포함한 여러 어플 리케이션에 사용되었습니다. MRI 및 MRS는 noninvasively 동물 해부학, 휴식 변화를 시각화하거나 nondestructively 신진 대사를 모니터링하는 유용한 기술입니다. 두 기술은 시간이 지남에 따라 위에서 언급한 변경 사항을 검토하기 위해 세로 모니터링 절차로 사용할 수 있습니다. MRS을 위해 우리는 동물이 수직 구멍 자석의 수평 위치에 유지되도록 사용자 정의 RF 프로브를 만들었습니다. 따라서이 실험은 대부분의 화학 부서에서 발견 등 모든 수직 넓은 구멍 자석을 수행할 수 있습니다.

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Acknowledgments

본 연구는 DL과 NIA AG028455 및 DJM위한 NIA AG022385에 NIH / NIBIB R21EB008166에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리가 그들의 D282 종양 생쥐를 제공 프레드 허친슨 암 연구 센터에서 박사 제임스 올슨 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T Varian Inc., Agilent Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T Varian Inc., Agilent Used for MRS of mouse skeletal muscle

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References

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Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures. J. Vis. Exp. (32), e1592, doi:10.3791/1592 (2009).

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