Summary
Postimplantation-dönem embriyoların İzolasyon bir gen desenlendirme hücre soy karar verme süreçlerini embriyonik gelişim sırasında çalışma ve analiz etmek için izin verir, fakat erken embriyo uygun diseksiyonu zor olabilir. Bu protokol erken ilkel bir çizgi-dönem embriyoların izole etmek için bir yöntem açıklanır (~ 6.5 gün coitum [DPC).
Abstract
Memeli embriyonik gelişimin erken aşamalarında gen ekspresyonu analizi, gen fonksiyonu, hücre-hücre etkileşimi ve sinyal mekanizmaları bu kılavuzu embriyonik desenlendirme hakkında önemli ipuçları sağlayabilir. Ancak, fare embriyo implantasyonu kısa bir süre sonra desidua diseksiyonu zor bir işlem olabilir ve bu sürecin ayrıntılı adım-adım belgelerine eksiktir.
Burada ilk kez hamile bir fare rahim diseksiyon (vajinal fiş belirlenen gün 0.5 poist coitum tespit) ve daha sonra embriyonun anne desidua diseksiyon post-implantasyon (6.5 DPC) embriyolar nasıl izole edilir göstermektedir. Reichert membran diseksiyonu ectoplacental koni kaldırılması yanı sıra açıklanmıştır.
Protocol
Bir dişi fare üreme organları diseksiyonu
- Gebe hayvanlar sıkıştırılmış gaz kullanarak CO 2 boğulma tarafından ötenazi.
- Emici ped hayvan yatar Lay ve fare saç diseksiyonu kontamine riskini azaltmak için% 70 etanol içinde bekletin.
- Cilt sıkın ve düzenli cerrahi makas ile orta hatta küçük bir yatay kesi yapmak. Sağlam bir şekilde yukarıdan ve kesi altında tutun ve cilt cilt dışında karın ortaya çıkarmak için baş ve kuyruk doğru çekin.
- Forseps ile tutun ve periton karın boşluğunda ortaya çıkarmak için kesilmiş.
- Iki, rahim boynuzları, yumurtalık ve yumurtalıkların: vücut boşluğuna dorsal bölgedeki üreme organları bulun.
İlkel Streak aşamalı (6.5 DPC) Diseksiyon
- Uterin horn rahim yumurtalık altında tutarak çıkarın ve mesometrium boyunca ücretsiz kesmek. Buz PBS disseke rahim yerleştirin.
Şekil 1 - Her embriyo rahim boynuz boyunca implantasyon siteler arasında keserek ayırın.
Şekil 2 - Saatçilik forseps çevresindeki kas tabakası ve zarflı desidua dokusu arasında kaydırarak kas rahim astar kavrayın. Peel, geri kas tabakası desidua ortaya.
Şekil 3 - Midventral veya distal ucu kapalı embriyo gösterecektir apeks (yaklaşık 1 / 5 desidua dokusu) maruz kalan desidua bir kısmını off klibi.
Şekil 4 - Forseps ve ipuçlarını kullanarak embriyo kabuklu olabilir. Pierce, forseps ve embriyo çevreleyen açık forseps ile desidua dışında desidua gözyaşı.
Şekil 5 - Bir kez embriyo kaldırılır, Reichart membran hala ectoplacental konisi (trofoblast) olarak de bağlı olabilir. Embriyo daha dikkatli diseksiyon ile disseke edilebilir.
Şekil 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare Postimplantation 4,5 DPC ve doğum arasında oluşur. Bu diseksiyon yöntemi olarak tanımlanan, aslında, önceki veya sonraki 5,5-8,5 DPC sahne embriyolar izole etmek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Forceps serrated, straight | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | 2 pairs |
| Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | 2 pairs |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) | Reagent | Invitrogen | 14190 | |
| Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Reagent | |||
| Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Tool | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pregnant female mice | Animal | |||
| Dissecting Microscope | Microscope |
References
- Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).
