Summary
L'isolement des embryons au stade post-implantation permet d'étudier la structuration génétique et d'analyser les cellules de lignée processus de décision durant le développement embryonnaire, mais la dissection adéquate de l'embryon précoce peut s'avérer difficile. Ce protocole décrit une méthode pour isoler début primitive-série au stade d'embryons (~ 6,5 jours post coïtum [DPC]).
Abstract
L'analyse des profils d'expression génique au cours des étapes précoces du développement embryonnaire chez les mammifères peuvent fournir des indices importants sur la fonction du gène, cellule-cellule d'interaction et les mécanismes de signalisation qui guident la structuration embryonnaire. Cependant, la dissection de l'embryon de souris de la decidua peu après l'implantation peut être une procédure difficile et détaillées étape par étape la documentation de ce processus fait défaut.
Ici, nous montrons comment post-implantation (6,5 DPC) embryons sont isolés d'abord disséquer l'utérus d'une souris enceintes (détection de l'coïtum jour poist bouchon vaginal a été désigné 0,5) et ensuite disséquer l'embryon à partir decidua maternelle. La dissection de la membrane de Reichert est décrite ainsi que la suppression du cône ectoplacentaire.
Protocol
Dissection des organes reproducteurs d'une souris femelle
- Les femelles gravides sont euthanasiés par asphyxie à l'aide de CO 2 de gaz comprimé.
- Posez le dos des animaux sur le tampon absorbant et la tremper dans de l'éthanol à 70% pour réduire le risque de contamination de la dissection avec les cheveux de la souris.
- Pincer la peau et de faire une petite incision latérale à la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux réguliers. Tenez fermement la peau dessus et en dessous de l'incision et tirez la peau en dehors vers la tête et la queue afin d'exposer l'abdomen.
- Saisir le péritoine avec une pince et coupé à exposer la cavité abdominale.
- Repérez les organes de reproduction dans la région dorsale de la cavité du corps: deux cornes utérines, l'oviducte et les ovaires.
Primitive Streak stade (6,5 DPC) Dissection
- Retirez la corne utérine en saisissant l'utérus ci-dessous l'oviducte et couper le long de la libre mésométrium. Placez l'utérus disséqués dans PBS glacé.
Figure 1 - Séparez les embryons en coupant entre les sites d'implantation le long des cornes utérines.
Figure 2 - Saisir la muqueuse utérine en glissant musculaires pince d'horloger entre la couche musculaire et des tissus environnants decidua enveloppés. Peler la couche musculaire, exposant la caduque.
Figure 3 - Coupez une partie de la caduque exposés à l'apex (environ 1 / 5 du tissu decidua), qui exposera la pointe midventral ou distal de l'embryon clos.
Figure 4 - L'embryon peut être bombardé à l'aide du bout des pinces. Pierce la caduque avec une pince entourant l'embryon et les forceps ouverte à la déchirure decidua dehors.
Figure 5 - Une fois que l'embryon est enlevé, la membrane Reichart a peut-être encore attachés, ainsi que le cône ectoplacentaire (le trophoblaste). L'embryon peut être disséqué encore par une dissection minutieuse.
Figure 6
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Discussion
Postimplantatoire chez la souris se situe entre 4,5 DPC et de la naissance. Cette méthode de dissection peut être appliquée, essentiellement comme décrit, d'isoler plus tôt ou plus tard au stade de 5.5 à 8.5 embryons DPC.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Forceps serrated, straight | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | 2 pairs |
| Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | 2 pairs |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) | Reagent | Invitrogen | 14190 | |
| Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Reagent | |||
| Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Tool | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pregnant female mice | Animal | |||
| Dissecting Microscope | Microscope |
References
- Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).
