Summary
El aislamiento de embriones etapa post-implantación, permite estudiar los patrones de genes y analizar células de linaje toma de decisiones durante el desarrollo embrionario, aunque la disección adecuada del embrión temprano puede ser un desafío. Este protocolo describe un método para aislar las primeras etapas primitivas racha de embriones (~ 6,5 días post coitum [dpc]).
Abstract
Análisis de patrones de expresión génica durante las primeras etapas del desarrollo embrionario de mamíferos pueden proporcionar pistas importantes sobre la función del gen, la célula-célula la interacción y los mecanismos de señalización que guía los patrones embrionarias. Sin embargo, la disección del embrión de ratón de la decidua, poco después de la implantación puede ser un procedimiento difícil y detalladas paso a paso la documentación de este proceso es insuficiente.
Aquí se demuestra cómo después de la implantación (6,5 dpc), los embriones se encuentran aisladas por primera disección del útero de un ratón embarazadas (detección de coitum el tapón vaginal fue designado poist días 0,5) y, posteriormente, la disección del embrión a partir de la decidua materna. La disección de la membrana de Reichert se describe así como la eliminación del cono ectoplacental.
Protocol
La disección de los órganos reproductores de una hembra de ratón
- Los animales en gestación son sacrificados por asfixia de CO 2 de gas comprimido.
- Coloque el animal en decúbito supino almohadilla absorbente y sumergirlo en etanol al 70% para reducir el riesgo de contaminación de la disección con el pelo del ratón.
- Pellizcar la piel y hacer una pequeña incisión lateral en la línea media con regulares tijeras quirúrgicas. Mantener la piel firme por encima y por debajo de la incisión de la piel y tirar hacia fuera de la cabeza y la cola para exponer el abdomen.
- Sujete el peritoneo con una pinza y se corta a exponer la cavidad abdominal.
- Localizar los órganos reproductivos en la región dorsal de la cavidad del cuerpo: dos cuernos uterinos, el oviducto y los ovarios.
Raya primitiva etapa (6,5 dpc) Disección
- Quitar el cuerno uterino, tome el útero por debajo del oviducto y cortar libre a lo largo del mesometrio. Lugar útero disecados en PBS enfriado con hielo.
Figura 1 - Separe cada embrión, por el corte entre los lugares de implantación a lo largo de los cuernos uterinos.
Figura 2 - Sujete el revestimiento del útero muscular deslizando pinzas de relojero entre la capa muscular y el tejido circundante decidua envuelto. Pele la capa muscular, la exposición de la decidua.
Figura 3 - Clip de una porción de la decidua expuestos en el vértice (aproximadamente 1 / 5 de los tejidos decidua), que expondrá la punta midventral o distal del embrión encerrado.
Figura 4 - El embrión puede ser bombardeado a cabo utilizando las puntas de unas pinzas. Pierce la decidua con unas pinzas que rodea al embrión y pinzas abiertas al desgarro decidua aparte.
Figura 5 - Una vez que se extrae de embriones, la membrana Reichart todavía puede estar unido, así como el cono ectoplacental (trofoblasto). El embrión puede ser diseccionado más de una cuidadosa disección.
Figura 6
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Discussion
Post-implantación en el ratón produce entre 4,5 dpc y el parto. Este método de disección puede ser aplicado, esencialmente como se describe, para aislar antes o después de los embriones en etapa de 5.5-8.5 DPC.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Forceps serrated, straight | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | 2 pairs |
| Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | 2 pairs |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) | Reagent | Invitrogen | 14190 | |
| Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Reagent | |||
| Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Tool | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pregnant female mice | Animal | |||
| Dissecting Microscope | Microscope |
References
- Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).
