자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

Summary

전기 분야의 응용 프로그램에 의해 전극의 배열에 - 디지털 Microfluidics는 개별 방울 (ML ~ NL)의 조작에 의해 특징 기법입니다. 그것은 빠른 속도, 순차, 소형 자동 생화학 assays을 수행에 적합합니다. 여기서 우리는 몇 가지 proteomic 처리 단계를 자동화 할 수있는 플랫폼을보고합니다.

Abstract

임상 proteomics는 질병의 조기 진단과 예후에 대해 도움이 될 생체의 발견 약속, 중요한 새로운 분야로 떠오르고있다. 임상 proteomic 방법이 다양하지만, 일반적인 특성은 매우 이질적인 유체 (즉, 혈청, 전혈 등) 사전 분석 (2) 광범위한 생화학 처리 단백질의 추출 (I)가 필요합니다. 여기, 우리는 임상 proteomics에 사용되는 몇 가지 처리 단계를 통합하는 새로운 디지털 microfluidics (DMF) 기반의 방법을보고합니다. 이것은 단백질 추출, resolubilization, 감소, 알킬화 및 효소 소화가 포함되어 있습니다. 디지털 microfluidics은 nanoliter - microliter 크기 방울이 열려있는 표면에 조작하는 microscale 유체 처리 기술입니다. 방울이 유전체 층으로 코팅 아르 전극의 배열의 상단에 위치 - 전기 가능성이 비말에 적용하면 요금이 유전체의 양쪽에 축적. 요금은 비말의 위치를​​ 제어하는​​ 데 사용할 수있는 정전기 손잡이 역할을하고, 일련의 전극의 순서를 바이어스에 의해 방울은 분배 이동, 병합, 혼합, 그리고 표면에 분할 할 수 있습니다. 따라서, DMF는 빠르게, 순차, 다단계, 소형 자동 생화학 assays를 운반하는데 자연 적합합니다. 이것은 종래의 방법 (수동 또는 로봇 pipetting에 의존)을 통해 상당한 발전을 대표하고, 임상 proteomics에 유용한 새로운 도구가 될 수있는 잠재력이있다.

메 J. Jebrail, 비비안 N. 룩, 그리고 스티브 CC Shih이 작품에 동등하게 공헌했습니다.

세르지오 LS 프레이리의 현재 주소는 600 사우스 43 번가, 필라델피아, PA 19104에 위치한 사이언스 대학에 있습니다.

Protocol

1 부 : 장치 제작

1. 피라 냐가 솔루션의 클린 유리 기판 (3시 1분 CONC 황산 :. 30 % 과산화수소). 자주 교반 10 분 피라 냐가 솔루션의 기판을 둡니다.
2. deionized (DI) 물에 rinsing와 N ₂ 가스로 기판을 건조 후, 크롬 증착 (250 nm의 두께)에 대한 전자빔 챔버 내부에 기판을 배치.
3. 크롬 코팅 기판 탈수, 115에서 5 분 뜨거운 접시에 빵을 다음 이소프로판올에 씻어 ° C.
4. 스핀 코팅 (30 S, 3000 RPM)에 의해 헥사메틸디실아젠 (HMDS)와 기판 및 주요 건조. 시플리 S1811 포토 레지스트로 다시 스핀 - 코팅 (동일한 매개 변수를 사용하여).
5. 사전 베이킹 핫 플레이트 (100 ° C, 2 분)에 기판, 다음 패턴 photomask를 통해 5 S에 대한 자외선 (UV) 방사선에 노출에 의해 포토 레지스트.
6. DI 워터에서 3 분 및 세척을위한 시플리 MF 321 개발자의 UV - 노출된 기판을 개발. 100 뜨거운 접시에 포스트 - 베이크 1 분 ° C.
7. 30 S.에 대한 크롬 에칭에 immersing에 의해 에칭 노출 크롬 남아있는 포토 레지스트를 제거하는 10 분 AZ300T 스트리퍼에서 다음 젖어, 디 물에 헹굼. DI 물에 씻어 N ₂ 가스로 건조.
8. 크롬을 패턴 기판 베어링에 보증금 2-5 μm의 화학 기상하여 Parylene - C (단열 고분자) 증착. 보증금 60 S. 2000 RPM에서 스핀 코팅 솔루션 (1 % Fluorinert에 WT / WT FC - 40)에 의해 테플론 - AF 50 NM (표면 소수성를 만들기 위해) 핫 플레이트 (160 ° C, 10 분)에 게시 - 베이크.
9. 상단 플레이트 형태로, 코트 위에서 취소 패턴 인듐 주석 산화물 (ITO) 유리 기판 50 nm의 테플론 - AF.
10. 핫 플레이트 (160 ° C, 10 분)에 두 기판을 게시 - 베이크.

2 부 : 장치 설정 및 자동화

1. "두 판"구성 운영 디지털 microfluidic 장치에 ¹ 방울은 바닥 기판 (패턴 전극) 및 최고의 기판 (일반적으로 ITO에서 형성 일 연속, 투명 전극과) 사이에 위치하고 있습니다.
2. 장치를 설정하려면, 때론 부드러운 근근이 살아가고하여 하단 기판의 접촉 패드에서 폴리머 코팅을 제거합니다. 커플 40 핀 커넥터 (그림 1A)와 하단의 기판의 패드를 찾아냈다.
3. 전원에 LabView (내쇼날 인 스트 루먼트, 오스틴, TX), 가정 내장된 컨트롤 박스 (내쇼날 인스 트루먼 트의 DaqPad의 신호에 의해 제어되는 고전압 릴레이의 배열을 갖춘), 함수 발생기 및 증폭기를 실행하는 컴퓨터 . 컴퓨터 / 제어 박스 100 V _RMS / 40 핀 커넥터를 통해 장치를 18 kHz에서 신호의 애플 리케이션을 통해 사용자 정의 컨트롤을 용이하게합니다.
4. 하단 기판의 가장자리에 위치 양면 테이프 두 조각 (140 μm의 총 두께)에 의해 장치를 조립하고 unpatterned ITO 슬라이드 (상단 플레이트)로 작성해야합니다.
5. 제어 시스템을 초기화하려면, 피드백 제어를 보정하기 위해 LabView 보정 프로그램 (자체 작성)를 실행합니다.
6. 해당 저수지 (아래 3 항 참조)에 샘플 및 시약을로드하고 상단 기판 (테플론 코팅 면이 아래로 향하게)으로 그들을 묶으십시오. 상단 기판에 접지 커넥터를 연결합니다.
7. LabView에서 작동 코드 (자체 작성)로드 및 비말의 작동을 시작하려면 프로그램을 실행합니다.

3 부 : 샘플 및 시약 준비

1. 100 MM TrisHCl (산도 7.8)와 0.08 %의 Pluronic F127 w / V. : 작업 버퍼 (WB)를 준비
2. 같은 그림 1B에 표시된 WB와 피펫 예제에서 장치에 저수지 1 (R - 1)로 분석하는 단백질 (S), 디졸브.
3. R - 2로 침전제, 20 % Trichloroacetic 디 물 속에 산성 (TCA)와 피펫을 준비합니다.
4. 버퍼를 씻어 준비, 30분의 70 클로로포름 / acetonitrile (ACN)와 피펫 R - 4로.
5. R - 5로 resolubilizing 버퍼, 100 MM의 탄산수 소 암모늄 (산도 8.0)와 0.08 % Pluronic F127 W / V 및 피펫를 준비합니다.
6. R - 6에 WB와 피펫 10 MM에 reductant, 트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine (TCEP)를 디졸브.
7. R - 7으로 WB와 피펫 12 MM에 alkylating 에이전트 iodoacetamide (IAM)를 디졸브.
8. R - 8로 전체 단백질 샘플의 농도 (위, 3.1 참조) 피펫의 to1 / 5와 같은 농도에서 WB에 트립신을 디졸브.

4 부 : 디지털 Microfluidic 샘플 처리

1. 다음 절차는 자체로 작성된 LabView 코드에 의해 자동으로 구현됩니다. 저수지에서 적절 방울의 볼륨은 전극 (이 경우, 적절 방울이 ~ 600nL 있습니다)의 크기에 의해 정의됩니다.
2. R - 1 단백질 함유 시료의 비말과 R - 2 (그림 2, 프레임 1)에서 침전제의 비말을 분배. 두 방울을 병합하여 통합 비말은 PR의 강수량 그 결과, 5 분 품어 수표면에 oteins (그림 2, 프레임 2-3). 폐기물 저수지, R - 3 (그림 2, 프레임 4) 떨어진 시켰던 단백질에서 뜨는을 행동시키다.
3. R - 4에서 세척 버퍼 세 방울을 분배하고 폐기물 저수지, R - 3 (그림 2, 프레임 5)에 시켰던 단백질에 걸쳐 몰아라.
4. 침전물은 건조하도록 허용하고, 단백질에 R - 5 resolubilizing 버퍼의 비말을 분배. 침전물은 (그림 2, 프레임 6) 해산 때까지 버퍼 20 분 부화 수 있습니다.
5. R - 6에서 reductant의 비말을 분배하고 샘플 비말로 병합합니다. 원형 패턴 6 전극에 걸쳐 그것을 작동하여 결합 비말을 섞는다. 비말은 humidified 챔버 (그림 3, 프레임 1-2)에 실온에서 1 H에 대한 부화 수 있습니다.
6. R - 7에서 에이전트를 alkylating의 비말을 분배하고 (4.5)를 혼합하여 다음 예제 비말, 그것을 병합합니다. 비말은 빛으로부터 보호 humidified 챔버에 상온에서 15 분, (그림 3, 프레임 2-3)에 대한 부화 수 있습니다.
7. R - 8 트립신의 비말을 분배하고, (4.5)를 혼합하여 다음 예제 비말, 그것을 병합합니다. 비말, 37 3 H에 대한 부화 ° C를 철판에 humidified 챔버 (그림 3, 프레임 3-4)에서 수 있습니다.

제 5 부 : 후처리 샘플 준비

1. 물에 2.5 % trifluoroacetic 산성의 0.6 ML를 추가하여 최고 기판과 담금질의 소화 반응을 제거합니다.
2. 제조 업체의 지침에 따라 C18 ZipTips을 (Millipore, 빌레 리카, MA)를 사용하여 침묵 반응 생성물을 정화.
3. 100 ML의 최종 볼륨 디 물 샘플을 정화 희석.

6 부 : 질량 분광법

1. 탠덤 질량 분석기로 성관계를 나노 HPLC에 처리 샘플을 평가합니다. HPLC 시스템은 Eksigent 테크놀로지이며 트랩 칼럼 (3mm의 디아. C18 비즈, 150 μm의 ID를 X 2.5 cm)와 반전 상 분리 칼럼 (3 μm의 디아 갖춘 여기서 사용됩니다. C18 비즈, 75 μm의 ID x는 15cm). 여기에 사용되는 질량 분석기는 써모 피셔 사이 언티픽 -에서 LTQ입니다.
2. 물에 5 % acetonitrile로 구성된 모바일 단계에 5μL/min에서 트랩 칼럼에 2 μL 샘플을로드합니다. 20 % acetonitrile에서 25 분 이상 80 % acetonitrile에 선형 그라데이션을 사용하여 0.5μL/min에 반대 위상 칼럼에서 샘플을 분리. 또 다른 10 분에 대해 80 % acetonitrile에서 실행을 계속합니다.
3. 탠덤 질량 분광법에 의한 열의를 eluting 밴드를 분석합니다. 작품 여기보고에서, eluent는 NewObjective에서 nanoelectrospray 방출기 (10 μm의 ID와 테이퍼 20 μm의 아이디)를 통해 질량 분석계로 샘플링됩니다.
4. SEQUEST 같은 데이터베이스 검색 프로그램을 사용하여 샘​​플에서 단백질을 식별합니다. 이 작품에서는, 우리는 Bioworks v3.01 (온습 피셔 사이 언티픽)에 통합 SEQUEST의 버전을 사용하고, 확인된 단백질은 1.0E - 03 미만의 확률 점수 (99.9 % 신뢰 구간에 해당) 및시의 시퀀스 coverages 있었 최소 30 % (그림 4).

그림 1. (A) 사진 자동 비말의 작동을위한 40 핀 커넥터에 DMF 장치를 성관계를합니다. (B) 장치의 개략도는 샘플과 proteomic 검사 결과에 필요한 시약의 위치를​​ 묘사.

영화에서 그림 2. 프레임은 20 % TCA (침전제)와 30분의 70 %의 클로로포름 / acetonitrile (솔루션 린스)의 자동 추출 및 BSA의 정화를 묘사. 프레임 6, 시켰던 단백질 100 MM의 탄산수 소 암모늄의 비말에 redissolved 있습니다.

그림 3. 순차 감소, 알킬화 및 resolubilized 단백질의 비말의 소화를 설명하는 동영상에서 프레임. 이 그림에서는 시약은 지혜로움에 대해 염료와 색, 연습, 시약은 색 없습니다.

디지털 microfluidics 처리 소 혈청 알부민의 샘플 그림 4. MS의 크로마토 그램. 25 서로 다른 펩티드는 44%의 시퀀스 범위를 해당 (99.9 % 신뢰 구간) 확인되었습니다.

Discussion

proteomics의 표준 시료 처리 및 가공의 부족은 필드에 대한 중요한 제한 사항입니다. 또한, 기존의 macroscale 샘플 처리 손실 및 오염을 샘플로 이어질 수있는 여러 컨테이너 및 솔루션 전송을 포함합니다. 이러한 문제에 대한 잠재적인 해결책은 디지털 microfluidics ¹ (DMF)에 의존 샘플 처리를위한 통합 시스템을 형성하는 것입니다. 이전 작품에서는, DMF는 이기종의 불필요한 오염 물질의 효율적인 제거 단백질이 포함된 솔루션을 유용하는 표시했다. 마찬가지로 ^2, DMF는 통합에 대한 다단계 솔루션 위상 처리의 통합 (감소, 알킬화와 소화)와 호환되도록 표시되었습니다 장치. 여기 ³ 우리는 솔루션 위상 처리 다음 강수량에 의해 단백질의 추출을위한 자동 비말 컨트롤과 함께 완벽하게 통합된 시스템을 증명하고있다. 우리는 이와 같은 방법을 널리 채택있다면, proteomic 샘플 처리에 내재된 인간의 오류가 대부분 더 나은 재현성과 분석의 결과, 제거 될 수 있다고 추측. 간단히 말해서, 우리는 조건이 정확하게 세계 어느 실험실에서 따라할 수로 DMF는, 애플 리케이션의 광범위한 단면에 유용되고있는 잠재 있다고 제안합니다.