A microfluídica digital para processamento automatizado Proteômica

Summary

A microfluídica Digital é uma técnica caracterizada pela manipulação de gotículas discretas (~ nL - mL) em uma matriz de eletrodos pela aplicação de campos elétricos. É bem adequado para a realização rápida, seqüencial, miniaturizados automatizado ensaios bioquímicos. Aqui, nós relatamos uma plataforma capaz de automatizar várias etapas de processamento proteômica.

Abstract

Proteômica clínica surgiu como uma disciplina nova e importante, prometendo a descoberta de biomarcadores que serão úteis para o diagnóstico precoce e prognóstico da doença. Enquanto os métodos clínicos proteômica variam muito, uma característica comum é a necessidade de (i) extração de proteínas a partir de fluidos extremamente heterogênea (ou seja, soro, sangue total, etc) e (ii) o tratamento extensivo bioquímicos antes da análise. Aqui, nós relatamos uma nova digitais microfluídica (DMF) método baseado integrar várias etapas de processamento utilizado em proteômica clínica. Isto inclui a extração de proteínas, resolubilization, redução, alquilação e digestão enzimática. Digital microfluídica é uma técnica de manipulação de fluidos em microescala em que gotículas nanolitros-microlitro empresas são manipulados em uma superfície aberta. Gotículas são posicionados no topo de uma série de eletrodos que são revestidas por uma camada dielétrica - quando um potencial elétrico é aplicado para a gota, as cargas se acumulam em cada lado do dielétrico. As taxas servem como alças eletrostática que pode ser usado para controlar a posição das gotas, e por uma seqüência de polarização de eletrodos em série, as gotas podem ser feitas para dispensar, mover, fundir, misturar e dividir na superfície. Portanto, DMF é um ajuste natural para a realização rápida, de várias etapas, seqüencial, miniaturizados automatizado ensaios bioquímicos. Isto representa um avanço significativo em relação aos métodos convencionais (contando com pipetagem manual ou robôs), e tem o potencial para ser uma ferramenta útil em proteômica nova clínica.

Mais J. Jebrail, Vivienne N. Lucas e Steve CC Shih contribuíram igualmente para este trabalho.

Endereço atual Sergio LS Freire é da Universidade de Ciências da Filadélfia localizado na 600 South 43 Street, Philadelphia, PA 19104.

Protocol

Parte 1: Fabricação de Dispositivos

1. Limpar substratos de vidro em solução Piranha (3:1 ácido sulfúrico concentrado:. Peróxido de hidrogênio 30%). Deixe a substratos em solução Piranha para 10 min com agitação freqüente.
2. Após lavagem em água deionizada (DI) e secagem dos substratos com gás N _2, coloque os substratos dentro da câmara de feixe de elétrons para o cromo deposição (espessura de 250 nm).
3. Para desidratar o substrato revestido de cromo, enxágüe em isopropanol e depois assar em uma placa quente por 5 min a 115 ° C.
4. Secar a substratos e privilegiada, com hexametildissilazano (HMDS) por revestimento rotacional (30 s, 3000 rpm). Spin-coat novamente (usando parâmetros idênticos) com Shipley fotorresiste S1811.
5. Pré-assar o substrato em uma placa quente (100 ° C, 2 min), então o padrão de fotorresiste por exposição à radiação ultravioleta (UV) por 5 s através de uma fotomáscara.
6. Desenvolver os substratos UV exposta em Shipley MF 321 developer por 3 min e lavar em água DI. Pós bake-em uma placa quente a 100 ° C por 1 min.
7. Cromo o Etch expostos por imersão em cromo etchant por 30 s. Enxágüe com água DI, então mergulhe no removedor AZ300T por 10 min para remover o fotorresiste restantes. Enxágüe em água DI e seca com gás N _2.
8. Depósito 2-5 mM deposição Parileno-C (um polímero isolante) por vapor químico em um substrato tendo modelado cromo. Depósito de 50 nm de Teflon-AF (para fazer o hidrofóbico superfície) através de spin-coating uma solução (1% wt / wt em Fluorinert FC-40) a 2000 rpm por 60 s. Pós bake-em uma placa quente (160 ° C, 10 min).
9. Para formar a chapa de topo, um casaco. Un-padrão óxido de estanho índio (ITO) substratos de vidro de 50 nm Teflon-AF, como acima
10. Pós-bake ambos os substratos em um prato quente (160 ° C, 10 min).

Parte 2: Dispositivo de Set-up e Automação

1. Em digital dispositivos microfluídicos operado em "dois-placa" de configuração, ^um gotículas são posicionados entre um substrato de fundo (com eletrodos padronizados) e um substrato de topo (com um eletrodo, contíguo transparente, geralmente formado a partir de ITO).
2. Para definir o dispositivo acima, remover revestimentos de polímero das pastilhas de contato de um substrato de fundo, raspando gentil com um bisturi. O casal expostas almofadas do substrato de fundo com 40 pinos (Figura 1a).
3. Power-on um computador com LabView (National Instruments, Austin, TX), uma casa construída caixa de controle (com uma série de relés de alta tensão que são controlados por sinais de uma National Instruments DaqPad), um gerador de função, e um amplificador . A caixa de computador / controle facilita o controle do usuário sobre aplicação de 100 V _RMS / 18 kHz sinais para o dispositivo através dos conectores de 40 pinos.
4. Montar o dispositivo de posicionamento por dois pedaços de fita dupla face (140 mM espessura total) nas bordas do substrato e completa com slides unpatterned ITO (placa superior).
5. Para inicializar o sistema de controle, execute o programa de calibração LabView (escrito in-house) para calibrar o controle feedback.
6. Carga da amostra e reagentes para os reservatórios apropriada (ver secção 3, abaixo) e colocá-los sob o substrato superior (Teflon revestido virado para baixo). Ligue o conector de terra para o substrato superior.
7. Carregar o código de atuação em LabView (escrito in-house) e executar o programa para iniciar atuação gota.

Parte 3: Preparação de amostras e reagentes

1. Prepare-tampão de trabalho (WB): 100 mM TrisHCl (pH 7,8) e 0,08% PLURONIC F127 w / v.
2. Dissolver proteína (s) a serem analisados ​​na amostra WB e pipeta no reservatório de 1 (R-1) no dispositivo, como mostrado na Figura 1b.
3. Prepare precipitante, 20% de ácido tricloroacético (TCA) em água DI e pipeta no R-2.
4. Prepare o tampão de lavagem, 70/30 Clorofórmio / acetonitrila (ACN) e pipeta no R-4.
5. Prepare tampão resolubilizing, 100 Bicarbonato de Amônio mM (pH 8,0) e 0,08% PLURONIC F127 w / v, e pipeta no R-5.
6. Dissolver redutor, tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), às 10 mM na WB e pipeta no R-6.
7. Dissolver agente alquilante, iodoacetamida (IAM), com 12 mM na WB e pipeta no R-7.
8. Dissolver tripsina na WB em uma concentração igual para 1 / 5 da concentração da amostra de proteína total (ver 3.1, acima) e pipeta no R-8.

Parte 4: Processamento Digital Amostra microfluídicos

1. O procedimento a seguir é executado automaticamente por meio de código escrito em LabView-house. O volume das gotas dispensadas dos reservatórios é definido pelas dimensões dos eletrodos (neste caso, as gotas são dispensados ​​~ 600nL).
2. Dispensar uma gota de proteínas contendo amostra do R-1 e uma gota de precipitante de R-2 (Figura 2, Quadro 1). Mesclar as duas gotas e permitir que a gota combinados para incubar por 5 min, resultando na precipitação de proteins sobre a superfície (Figura 2, Quadros 2-3). Accionar o sobrenadante longe da proteína precipitada para o reservatório de resíduos, R-3 (Figura 2, Quadro 4).
3. Dispensar três gotas de solução de lavagem a partir de R-4 e conduzi-los através da proteína precipitada para o reservatório de resíduos, R-3 (Figura 2, Quadro 5).
4. Permitir que o precipitado para secar, e dispensar uma gota de tampão resolubilizing de R-5 à proteína. Permitir que o buffer para incubar por 20 min até que o precipitado foi dissolvido (Figura 2, Quadro 6).
5. Dispensar uma gota de redutor de R-6 e mesclá-lo com a gota de amostra. Misture a gota combinado acionando-lo ao longo de 6 eletrodos em um padrão circular. Permitir a gota para incubar por 1 hora a temperatura ambiente em câmara úmida (Figura 3, Quadros 1-2).
6. Dispensar uma gota de agente alquilante de R-7 e mesclá-lo com a gota da amostra, seguida de mistura (como em 4.5). Permitir a gota para incubar por 15 min à temperatura ambiente em câmara úmida, protegido da luz (Figura 3, Quadros 2-3).
7. Dispensar uma gota de tripsina de R-8, e mesclá-lo com a gota da amostra, seguida de mistura (como em 4.5). Permitir a gota para incubar por 3 horas a 37 ° C em câmara úmida sobre uma chapa quente (Figura 3, Quadros 3-4).

Parte 5: Pós-Processamento Preparação da Amostra

1. Remover substrato superior e reação saciar a digestão pela adição de 0,6 mL de 2,5% de ácido trifluoroacético na água.
2. Purify produto da reação extinto usando ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) de acordo com instruções do fabricante.
3. Diluir em água purificada amostra DI para um volume final de 100 mL.

Parte 6: Espectrometria de Massa

1. Avaliar a amostra processada em um nano-HPLC acoplado a um espectrômetro de massa em tandem. O sistema de HPLC usado aqui é a partir Technologies Eksigent e está equipado com uma coluna de armadilha (3 mm de diâmetro. Contas C18, 150 ID M x 2,5 cm) e uma coluna de separação de fase reversa (3 mM dia. Contas C18, 75 mM ID x 15 cm). O espectrômetro de massa usada aqui é um LTQ da Thermo Fisher Scientific-.
2. Carregar uma amostra 2 mL para a coluna na armadilha 5μL/min em uma fase móvel composta de acetonitrila 5% em água. Separado da amostra na coluna de fase reversa em 0.5μL/min usando um gradiente linear de acetonitrila 20% a 80% acetonitrila mais de 25 min. Continuar a funcionar com 80% de acetonitrila por mais 10 min.
3. Analisar as bandas de eluição fora da coluna por espectrometria de massa em tandem. No trabalho aqui relatado, o eluente é amostrado no espectrômetro de massa através de um emissor nanoelectrospray (20 mM ID reduzida para 10 ID mm) de NewObjective.
4. Identificar as proteínas da amostra usando um programa de pesquisa de banco de dados, tais como SEQUEST. Neste trabalho, foi utilizada a versão do SEQUEST incorporadas Bioworks v3.01 (Thermo Fisher Scientific-), e proteínas identificadas tiveram escores probabilidade de menos de 1.0E-03 (equivalente a 99,9% intervalo de confiança), e coberturas na seqüência de pelo menos 30% (Figura 4).

Figura 1. (A) Uma imagem de um dispositivo acoplado a DMF 40 pinos para atuação gota automatizado. (B) Um esquema de um dispositivo que descreve o posicionamento de amostra e reagentes necessários para um workup proteômica.

Figura 2. Quadros de um filme retratando a extração automatizada e purificação da BSA no TCA 20% (precipitante) e acetonitrila% 70/30 clorofórmio / (Solução de lavagem). No quadro 6, a proteína é precipitado redissolvido em uma gota de bicarbonato de amônio 100 mM.

Figura 3. Quadros de um filme ilustrando redução seqüencial, alquilação e digestão de uma gota de proteína ressolubilizam. Nesta figura, os reagentes são tingidos com corantes para maior clareza, na prática, os reagentes não são coloridos.

Figura 4. Cromatograma MS de uma amostra de albumina bovina processada por microfluídica digital. 25 peptídeos distintos foram identificados (99,9% intervalo de confiança) correspondente seqüência de uma cobertura de 44%.

Discussion

A falta de manuseio de amostras e processamento padronizados em proteômica é uma grande limitação para o campo. Além disso, o manuseamento da amostra convencional macroescala envolve vários containers e transferências de solução, que pode levar à perda de amostra e de contaminação. Uma solução potencial para estes problemas é a forma de sistemas integrados para o processamento da amostra depender digitais microfluídica ¹ (DMF). Em trabalhos anteriores, DMF mostrou-se útil para a remoção eficiente de contaminantes indesejados no heterogêneo de proteínas contendo soluções. ² Da mesma forma, DMF mostrou-se compatível com a integração das várias etapas de processamento de solução de fase (alquilação, redução e digestão), em um sistema integrado dispositivo. ³ Aqui, nós demonstramos um sistema totalmente integrado com controle automatizado para a extração de gotículas de proteína por precipitação seguido pela solução de fase de processamento. Nós especulamos que, se tais métodos como estes são amplamente adotado, o erro humano inerente ao processamento das amostras proteômica pode ser largamente eliminada, resultando em análises com melhor reprodutibilidade. Em resumo, propomos que DMF tem o potencial para ser útil para um amplo leque de aplicações, como as condições podem ser precisamente duplicado em qualquer laboratório do mundo.