Summary
Выделение постимплантационных стадии эмбрионов позволяет исследовать геном структурирования и анализа клеточных линии процессах принятия решений во время эмбрионального развития, но надлежащего вскрытия раннего эмбриона может оказаться непростой задачей. Этот протокол описывает метод выделения ранних примитивных-штрих стадии эмбрионов (~ 6,5 дней после coitum [DPC]).
Abstract
Анализ моделей экспрессии генов на ранних стадиях эмбрионального развития млекопитающих может предоставить важную информацию о функции гена, межклеточных взаимодействий и сигнальных механизмов, которыми руководствуются эмбриональных кучность стрельбы. Тем не менее, рассечение эмбриона мыши с децидуальной вскоре после имплантации может быть сложной процедурой, а также подробные шаг за шагом документации этого процесса отсутствует.
Здесь показано, как после имплантации (6,5 DPC) эмбрионы выделяли первых рассекает матку беременных мышей (обнаружение вагинальные плагин был назначен день 0,5 poist coitum), а затем рассекает эмбриона от материнского децидуальной. Рассечение мембраны Reichert это описано, а также удаление ectoplacental конуса.
Protocol
Препарирование репродуктивных органов у женщин мыши
- Беременных животных усыпляют СО 2 удушение с помощью сжатого газа.
- Положите животное на спине на абсорбирующую прокладку и положите его в 70% этанола, чтобы уменьшить риск загрязнения вскрытия с помощью мыши волос.
- Сожмите кожу и сделать небольшой боковой разрез на средней линии с регулярными хирургические ножницы. Держите кожу твердо выше и ниже разреза и потяните кожу в разные стороны в сторону головой и хвостом, чтобы разоблачить живота.
- Возьмитесь брюшины щипцами и сократить, чтобы разоблачить брюшной полости.
- Найдите репродуктивных органов в грудном отделе полости тела: два рога матки, маточных труб и яичников.
Примитивные подряд стадии (6,5 DPC) Препарирование
- Удалить рога матки, держа матки ниже яйцевода и разрезать его свободным вдоль mesometrium. Место расчлененный матки в ледяной PBS.
Рисунок 1 - Отдельные каждого эмбриона, сокращая между имплантации участков вдоль рога матки.
Рисунок 2 - Возьмитесь мышечной оболочки матки, сдвинув пинцетом часовщика в период с окружающим слоем мышц и тканей децидуальной окутан. Пил назад мышечного слоя, обнажая децидуальной.
Рисунок 3 - Клип от части обнаженной децидуальной на вершине (примерно 1 / 5 часть децидуальной ткани), которая подвергнет midventral или дистального кончика заключен зародыш.
Рисунок 4 - Эмбриона могут быть обстреляны с помощью кончиков пинцета. Пирс децидуальной щипцами окружающих эмбрион и открытые щипцы рвать децидуальной друг от друга.
Рисунок 5 - Как только эмбрион удаляется, мембранные Reichart может все еще быть прикреплен, а также конус ectoplacental (трофобласта). Эмбриона можно разрезать дальнейшего тщательного вскрытия.
Рисунок 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Постимплантационных у мышей происходит между 4,5 DPC и рождения. Это рассечение метод может быть применен, по существу, как описано, чтобы изолировать раньше или поздней стадии эмбрионов на 5.5-8.5 DPC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Forceps serrated, straight | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | 2 pairs |
| Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | 2 pairs |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) | Reagent | Invitrogen | 14190 | |
| Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Reagent | |||
| Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Tool | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pregnant female mice | Animal | |||
| Dissecting Microscope | Microscope |
References
- Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).
