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Biology

Microvolume प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण का उपयोग NanoDrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

Microvolume नमूने एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर प्रणाली है कि प्राकृतिक सतह तनाव का उपयोग करता है cuvettes या capillaries के उपयोग के बिना नमूने बनाए रखने के द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. प्रोटीन सांद्रता और गति है जिसके द्वारा वे मापा जा सकता है है गतिशील रेंज बहुत इस विधि के साथ बढ़ रहे हैं.

Abstract

पारंपरिक spectrophotometry cuvettes या capillaries में नमूने रखने की आवश्यकता है. यह अक्सर कारण सीमित नमूना अक्सर प्रोटीन विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया मात्रा करने के लिए अव्यावहारिक है. थर्मो वैज्ञानिक NanoDrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर एक अभिनव नमूना प्रतिधारण प्रणाली है कि दो माप तरल पदार्थ की सतह तनाव गुणों का उपयोग कर सतहों के बीच microvolume नमूने धारण के साथ इस मुद्दे को हल, मात्रा में 0.5-2 μL के रूप में कम के रूप में में नमूनों की मात्रा का ठहराव को सक्षम. cuvettes या capillaries के उन्मूलन पथ लंबाई में वास्तविक समय में परिवर्तन, जो माप समय कम कर देता है जबकि बहुत प्रोटीन सांद्रता है कि मापा जा सकता है गतिशील रेंज बढ़ाने की अनुमति देता है. dilutions के लिए की जरूरत है भी सफाया कर दिया है और नमूना मात्रा का ठहराव के लिए तैयारी अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं के रूप में माप सतहों बस प्रयोगशाला पोंछ के साथ सफाया हो सकता है है. यह वीडियो लेख microvolume मात्रा में प्रोटीन की A280 absorbance रीडिंग या बीसीए वर्णमिति परख का उपयोग की मात्रा का ठहराव के लिए पारंपरिक प्रोटीन एकाग्रता दृढ़ संकल्प तरीकों के लिए संशोधन प्रस्तुत करता है.

Protocol

NanoDrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर आई.

NanoDrop एक अभिनव नमूना प्रतिधारण प्रणाली है कि सतह के लिए पकड़ और cuvettes या capillaries के उपयोग के बिना microvolume नमूनों को मापने दो ऑप्टिकल pedestals के बीच तनाव का उपयोग करता है प्रौद्योगिकी पर आधारित है. NanoDrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर इस तकनीक का उपयोग करता है जल्दी और आसानी से प्रोटीन की 0.5-2 μL बूंदों, डीएनए, शाही सेना, और अन्य biomolecules उपाय है. यह क्षमता तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है आणविक तकनीक के रूप में लगातार विश्लेषण के लिए सामग्री के छोटे मात्रा का उपयोग विकसित. जिन स्थितियों में नमूना सीमित है के लिए microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर आदर्श. हालांकि, आसानी से उपयोग, तेजी से माप चक्र और, और व्यापक एकाग्रता रेंज भी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर उपयुक्त बनाने के लिए जब नमूने की पर्याप्त मात्रा में उपलब्ध हैं. माप चक्र भी बहुत कम है, वैज्ञानिकों उनके वर्कफ़्लो भर दक्षता बढ़ाने में मदद.

microsample सीधे पता लगाने की सतह के शीर्ष पर रखा है और एक तरल सतह तनाव द्वारा ऑप्टिकल फाइबर के सिरों के बीच स्तंभ बनाया है. यह तरल एक ऊर्ध्वाधर ऑप्टिकल पथ स्तंभ रूपों. एक क्सीनन फ़्लैश दीपक प्रकाश स्रोत और एक स्पेक्ट्रोमीटर उपयोग एक रेखीय सीसीडी सरणी के लिए प्रकाश है कि नमूना के माध्यम से गुजरता है विश्लेषण किया जाता है प्रदान करता है.

सिस्टम से cuvettes जैसे पारंपरिक रोकथाम उपकरणों हटाना कई फायदे हैं: नमूना की बहुत छोटी मात्रा माप के लिए की जरूरत है, सफाई केवल एक प्रयोगशाला पोंछ के साथ ऑप्टिकल सतहों पोंछते की आवश्यकता है, और पथ लंबाई माप के दौरान वास्तविक समय में बदला जा सकता है.

NanoDrop 2000C इष्टतम पथ लंबाई स्वचालित रूप से निर्धारित करता है (1 मिमी से 0.05 मिमी), dilutions के बिना संभव प्रोटीन एकाग्रता माप का सबसे व्यापक रेंज प्रदान. पथ लंबाई को छोटा करके, प्रोटीन की उच्च सांद्रता मापा जा सकता है. यह प्रभावी रूप से सबसे अधिक प्रोटीन के नमूने के लिए dilutions प्रदर्शन करने की जरूरत को हटा. उदाहरण के लिए, NanoDrop 2000C BSA के रूप में 400 मिलीग्राम / एमएल के रूप में उच्च सांद्रता उपाय कर सकते हैं.

NanoDrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर डीएनए, शाही सेना, प्रोटीन, और अन्य biomolecules के absorbance को मापने के लिए एक पूर्ण स्पेक्ट्रम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर है. यह वीडियो प्रोटोकॉल प्रोटीन के माप पर ध्यान दिया जाएगा.

द्वितीय. Microvolume प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण A280 absorbance माप का उपयोग करना

ए A280 माप के सिद्धांत

प्रोटीन A280 विधि, Tryptophan Tyrosine, फेनिलएलनिन अवशेषों या Cysteine ​​Cysteine ​​Disulphide बांड 280 एनएम और एक्ज़िबिट absorbance वाले प्रोटीन है कि शुद्ध करने के लिए लागू होता है. इस विधि या तो जन विलुप्त होने गुणांक या दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक के साथ संयोजन में A280 absorbance के मूल्य के लिए शुद्ध प्रोटीन की एकाग्रता की गणना का उपयोग करता है. प्रत्यक्ष A280 माप के लाभ यह है कि एक मानक वक्र की पीढ़ी के लिए प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए आवश्यक नहीं है. यदि नमूना एक uncharacterized प्रोटीन समाधान है, सेल lysate, या कच्चे प्रोटीन निकालने है, तो एक पूर्व विन्यस्त वर्णमिति NanoDrop 2000/2000c पर उपलब्ध बीसीए, पियर्स 660 एनएम, ब्रैडफोर्ड, और Lowry assays जैसे तरीकों, में से एक का उपयोग कर, की सिफारिश की.

ज. स्टार्टअप - Microvolume A280 माप प्रोटीन

  1. मुख्य मेनू से प्रोटीन A280 आवेदन का चयन करें.
  2. ड्रॉप - डाउन सूची से मापा जा नमूने के प्रकार का चयन करें. डिफ़ॉल्ट सेटिंग सबसे अज्ञात प्रोटीन मिश्रण जिसमें 1 Abs = 1 मिलीग्राम / एमएल. लिए सिफारिश की है यदि एक पहले से विशेषता शुद्ध प्रोटीन मापने, तो या तो जन विलुप्त होने के गुणांक या दाढ़ विलुप्त होने गुणांक और आणविक वजन के लिए प्रोटीन एकाग्रता और अधिक ठीक से निर्धारित प्रवेश किया जा सकता है.
  3. ड्रॉप - डाउन सूची से चुनें एकाग्रता इकाइयों.

सी. Microvolume प्रोटीन A280 माप - ब्लैंकिंग

  1. एक उपयुक्त बफर का उपयोग रिक्त स्थापित करना. यह बफर में जो प्रोटीन निलंबित कर दिया है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस्तेमाल किया बफर एक ही नमूना समाधान के रूप में एक समान ईओण ताकत का पीएच होना चाहिए. नोट: Ripa बफ़र्स 280 एनएम पर बहुत ज्यादा absorbance के योगदान और इसलिए प्रत्यक्ष A280 प्रोटीन माप के साथ असंगत हैं. एक Ripa बफर में निलंबित प्रोटीन के लिए, यह अनुशंसा की जाती है प्रोटीन एकाग्रता Ripa बफर संगत वर्णमिति परख का उपयोग करके निर्धारित किया जा.
  2. पिपेट 2 μL नीचे कुरसी पर उचित समाधान के blanking, कम हाथ और खाली क्लिक करें.
  3. निचले और ऊपरी उपयोग एक सूखी प्रयोगशाला पोंछ pedestals से रिक्त समाधान पोछो.

मृ Microvolume प्रोटीन A280 माप माप

अत्यंत महत्वपूर्ण विचार: नमूने की समरूपता हैऐसी छोटी मात्रा के बाद से महत्वपूर्ण मापा जा रहा है. यह सुनिश्चित करने के नमूने समरूप रहे हैं, धीरे, लेकिन अच्छी तरह से नमूनों को तुरंत माप के लिए एक विभाज्य लेने से पहले मिश्रण. जब मिश्रण और pipetting बुलबुले शुरू से बचें.

विभिन्न प्रोटीन के बीच सतह तनाव में परिवर्तनशीलता के कारण, हम नमूनों की 2 μL लोड हो रहा है सुनिश्चित करने के लिए उचित स्तंभ गठन करने की सलाह देते हैं. हमेशा कम प्रतिधारण विंदुक युक्तियाँ का उपयोग करें. एक नमूना लोड करने के लिए, और कम ऑप्टिकल कुरसी सतह विंदुक टिप स्पर्श जबकि विंदुक टिप के बाहर का पालन करने से समाधान को रोकने के लिए समाधान expelling. नमूना दरार और नमूने में बुलबुले की शुरूआत को रोकने की पूरी राशि से कम निष्कासित.

  1. उपयुक्त क्षेत्र में एक नमूना आईडी दर्ज करें, पहला नमूना खाली और क्लिक उपाय के लिए में वर्णित के रूप में 2 μL लोड. नमूने के एक ताजा 2μL विभाज्य प्रत्येक माप के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  2. निचले और ऊपरी उपयोग एक सूखी प्रयोगशाला पोंछ pedestals से नमूना निकालें.

ई. Microvolume प्रोटीन A280 सफाई माप

एक साधारण, एक प्रकार का वृक्ष मुक्त, प्रयोगशाला पोंछ अक्सर माप के बीच ऑप्टिकल pedestals के सफाई के लिए पर्याप्त है.

एफ प्रोटीन A280 Reconditioning माप बनाना

समाधान और surfactants युक्त अभिकर्मकों समय पर माप कुरसी सतहों uncondition फार्म का नमूना तरल स्तंभ को रोकने सकता है. कम आसन पर छोटी बूंद के एक सपाट ऑप्टिकल सतह असुविधाजनक बनने के संकेत है. यदि सतह के गुणों समझौता किया गया है, pedestals reconditioning नमूना स्तंभ गठन सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि ऐसा होता है, शौकीन सख्ती ऑप्टिकल प्रयोगशाला पोंछ या NanoDrop कुरसी Reconditioning यौगिक का उपयोग करें (पीआर 1) के रूप में निर्देशित का उपयोग कर सतहों.

III. Microvolume प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण वर्णमिति Assays का उपयोग

ए वर्णमिति का पता लगाने के सिद्धांत

NanoDrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर भी uncharacterized प्रोटीन समाधान, सेल lysates, और कच्चे प्रोटीन के अर्क वर्णमिति assays का उपयोग को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

वर्णमिति तरीकों अप्रत्यक्ष तरीकों कि नमूने के प्रोटीन घटक के लिए एक नया जटिल है कि दिखाई तरंगदैर्य रेंज में प्रकाश को अवशोषित उत्पादन के साथ एक डाई की बातचीत शामिल हैं.

NanoDrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर कई पूर्व विन्यस्त बीसीए, पियर्स 660, ब्रैडफोर्ड, और Lowry तरीकों सहित वर्णमिति assays है. बीसीए परख एक उदाहरण वर्णमिति एक microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग परख के रूप में प्रदर्शन किया जाएगा. (स्क्रीनशॉट)

बीसीए परख (Bicinchoninic एसिड) एक आम वर्णमिति अक्सर पतला प्रोटीन घटक है कि महत्वपूर्ण यूवी absorbance (280 एनएम) की उपस्थिति में समाधान और प्रोटीन के लिए विधि का इस्तेमाल किया है. प्रोटीन A280 विधि के विपरीत, प्रोटीन बीसीए विधि की आवश्यकता है कि एक मानक वक्र पहले नमूना प्रोटीन सांद्रता मापा जा सकता है है उत्पन्न हो.

विधि का पता लगाने अभिकर्मक के रूप में bicinchoninic एसिड (बीसीए) का उपयोग करता है. घन बीसीए प्रोटीन की उपस्थिति में गठन chelate 562 एनएम पर मापा जाता है और 750 एनएम पर सामान्यीकृत.

ज. Microvolume बीसीए परख माप बीसीए परख तैयारी

  1. बीसीए अभिकर्मक ए, बीसीए अभिकर्मक बी, संगतता अभिकर्मक, पुनर्गठन बफर, और albumin (BSA) मानकों: अभिकर्मकों की आवश्यकता को कम करने एजेंट संगत किट (. थर्मो वैज्ञानिक पियर्स बिल्ली 23,250) में निहित हैं.
  2. कमरे के तापमान पर सभी अज्ञात प्रोटीन और प्रोटीन मानकों को संतुलित करना और मिश्रण अच्छी तरह से.
  3. पर्याप्त मानकों और मापा जा नमूनों अभिकर्मक की एक 50:1 अनुपात एक का उपयोग करने के लिए नए सिरे से काम अभिकर्मक तैयार: B
  4. माइक्रो परख के लिए, नमूना के लिए काम अभिकर्मक के एक 1:1 के अनुपात का उपयोग करें. अभिकर्मक प्रत्येक ट्यूब करने के लिए पर्याप्त ट्यूबों के साथ सभी नमूनों और मानकों को कवर करने के लिए काम कर के 10 μL जोड़ें. उच्च रेंज परख के लिए, नमूना के लिए काम अभिकर्मक के 20:01 अनुपात का उपयोग करें. अभिकर्मक प्रत्येक ट्यूब करने के लिए पर्याप्त ट्यूबों के साथ सभी नमूनों और मानकों को कवर करने के लिए काम कर के 190 μL जोड़ें. पियर्स बीसीए किट साहित्य का संदर्भ लें निर्धारित करने के अनुपात जो अपने नमूनों के लिए उपयुक्त है.
  5. प्रत्येक अभिकर्मक युक्त ट्यूब के लिए मानक या नमूना के 10 μL जोड़ें. धीरे vortexing से अच्छी तरह मिक्स.
  6. 37 में ट्यूब सेते ° C 30 मिनट के लिए.
  7. प्रतिक्रियाओं को कमरे के तापमान (~ 10 मिनट) के लिए संतुलित के लिए अनुमति दें.

सी. Microvolume बीसीए परख उत्पन्न माप मानक वक्र

  1. मुख्य मेनू से प्रोटीन बीसीए विधि का चयन करें. यदि तरंगदैर्ध्य सत्यापन विंडो प्रकट होता है सुनिश्चित करने के लिए, हाथ नीचे है.
  2. दाएँ फलक तालिका में प्रत्येक मानक एकाग्रता के लिए मान दर्ज करें. सॉफ्टवेयर संदर्भ और 7 addit के लिए अनुमति देता हैional मानकों. संदर्भ और / या मानकों replicates में मापा जाना चाहिए.
    नोट: मानक वक्र पीढ़ी के लिए न्यूनतम आवश्यकता से दो मानकों की माप या शून्य संदर्भ और कम से कम एक मानक की माप है. यह अनुशंसा की जाती है कि अतिरिक्त मानकों उम्मीद परख एकाग्रता रेंज को कवर करने के लिए आवश्यक के रूप में शामिल किया जाना है.
  3. एक रिक्त स्थापित करना. वर्णमिति assays के लिए रिक्त आम तौर पर एच 2 ओ विआयनीकृत
  4. पिपेट नीचे कुरसी पर 2 DH 2 हे μL, कम हाथ और खाली क्लिक करें. केवल एक रिक्त संदर्भ और मानकों के बाद के सभी माप को कवर करने के लिए आवश्यक है.
  5. कम कुरसी पर कोई प्रोटीन के साथ एक 2 μL केवल काम अभिकर्मक और बफर युक्त विभाज्य pipetting द्वारा संदर्भ स्थापित करना. हाथ और कम क्लिक उपाय करें.
  6. मानक टैब के अंतर्गत, और वांछित कम कुरसी पर वांछित मानक के विंदुक 2 μL मानक पर प्रकाश डाला. हाथ और कम क्लिक उपाय करें. सभी मानकों के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ. सभी मानकों को मापने के नमूनों से पहले उपाय सुनिश्चित करें. मानक वक्र को देखने के लिए मानक वक्र देखें क्लिक करें.

मृ Microvolume बीसीए परख 2 μL प्रोटीन माप माप

  1. के बाद सभी मानक मापा गया है, नमूने बटन पर क्लिक करें. नमूना आईडी दर्ज करें. कम कुरसी पर नमूने के 2 μL लोड और उपाय पर क्लिक करें. नमूने के एक ताजा 2 μL विभाज्य प्रत्येक माप के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  2. निचले और ऊपरी उपयोग एक सूखी प्रयोगशाला पोंछ pedestals से नमूना पोछो.

ई. Microvolume बीसीए परख माप सफाई और Reconditioning

सफाई और reconditioning प्रत्यक्ष A280 absorbance के माप में वर्णित के रूप में प्रदर्शन.

प्रतिनिधि परिणाम:

Microvolume प्रोटीन एकाग्रता दृढ़ संकल्प या तो एक प्रत्यक्ष माप A280 या एक अप्रत्यक्ष वर्णमिति परख द्वारा किया जाता है. A280 माप उदाहरण प्रोटीन एकाग्रता हित के प्रोटीन के विलुप्त होने के गुणांक के आधार पर निर्धारित करता है. बीसीए वर्णमिति परख उदाहरण के प्रोटीन जाना जाता प्रोटीन सांद्रता के एक मानक वक्र के आधार एकाग्रता निर्धारित करता है.

Discussion

Microvolume quantitation दो माप सतहों के बीच एक तरल स्तंभ के रूप में एक नमूना की आंतरिक सतह तनाव गुण का उपयोग करता है. एक नियंत्रण डिवाइस के अभाव, पथ लंबाई वास्तविक समय में परिवर्तन करने के लिए, अनिवार्य रूप से dilutions प्रदर्शन करने की जरूरत को नष्ट करने की अनुमति देता है. यह क्षमता नाटकीय रूप से प्रोटीन सांद्रता के गतिशील रेंज के रूप में अच्छी तरह के रूप में माप की गति बढ़ जाती है. नमूना की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करके, नमूनों की एक बड़ी संख्या में जल्दी और सही ढंग से विश्लेषण किया जा सकता है, वैज्ञानिकों को और अधिक माप लेने के लिए और बेहतर गुणवत्ता नियंत्रण प्राप्त करने के अनुमति. इसके अलावा, और यदि आवश्यक हो तो, कीमती नमूने एक माप लेने के बाद बरामद किया जा सकता है. जब ऐसी छोटी मात्रा को मापा जा रहे हैं, नमूना एकरूपता नमूने त्रुटियों से बचने के अत्यंत महत्वपूर्ण है. कम प्रतिधारण विंदुक युक्तियाँ हमेशा लोडिंग नमूने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए और सुझावों के बीच नमूना प्रतिकृति बदला जाना चाहिए. कुरसी सतहों ठीक से और साफ होना चाहिए सबसे सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के वातानुकूलित. अंत में, microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर आदर्श है जब नमूना सीमित है, तथापि, आसानी से उपयोग करते हैं, गति, और स्पेक्ट्रोमीटर के व्यापक गतिशील रेंज यह उपयुक्त है जब नमूना बहुतायत से होता है.

Disclosures

लेखकों थर्मो फिशर साइंटिफिक कि इस लेख में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और उपकरणों की उत्पादन के कर्मचारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

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References

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Cite this Article

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

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