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Biology

Concentración de proteínas microvolumen Determinación mediante el NanoDrop 2000c Espectrofotómetro

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

Microvolumen muestras se han cuantificado mediante un sistema que utiliza un espectrofotómetro tensión superficial natural de retener las muestras sin el uso de cubetas o capilares. El rango dinámico de las concentraciones de proteínas y la velocidad con la que pueden ser medidos son mucho mayores con este método.

Abstract

Espectrofotometría tradicional requiere la colocación de muestras en cubetas o capilares. Esto a menudo es poco práctico debido a los volúmenes de muestra limitada de uso frecuente para el análisis de proteínas. El Thermo Scientific NanoDrop 2000c Espectrofotómetro resuelve este problema con un sistema de muestra de retención innovadores que contiene muestras microvolumen entre dos superficies de medición utilizando las propiedades de tensión superficial de los líquidos, lo que permite la cuantificación de las muestras en volúmenes tan bajos como 0.5 a 2 l. La eliminación de las cubetas o capilares permite cambios en tiempo real en la longitud del camino, lo que reduce el tiempo de medición mientras aumenta el rango dinámico de las concentraciones de proteínas que pueden ser medidos. La necesidad de diluciones también se elimina, y los preparativos para la cuantificación de la muestra es relativamente fácil ya que las superficies de medición puede ser simplemente borrado con el laboratorio de limpiar. En este artículo de vídeo presenta modificaciones a los métodos tradicionales de determinación de la concentración de proteínas para la cuantificación de las cantidades de la proteína usando microvolumen A280 lecturas de absorbancia o el ensayo colorimétrico BCA.

Protocol

I. El NanoDrop 2000c Espectrofotómetro

Tecnología NanoDrop se basa en un sistema de retención de la muestra innovadora que utiliza la tensión superficial para mantener y medir muestras microvolumen entre dos pedestales ópticas sin el uso de cubetas o capilares. El NanoDrop 2000c espectrofotómetro utiliza esta tecnología para medir rápida y fácilmente las gotas de 0,5-2 l de proteínas, ADN, el ARN y otras biomoléculas. Esta capacidad se ha convertido cada vez más importante como las técnicas moleculares evolucionan continuamente a utilizar pequeñas cantidades de material para el análisis. El ideal espectrofotómetro microvolumen de condiciones en las que la muestra es limitado. Sin embargo, la facilidad de uso, el ciclo de medición rápida y extensa gama de concentración y también hacen que el espectrofotómetro adecuado, cuando grandes cantidades de muestra están disponibles. El ciclo de medición también es reducido en gran medida, ayudando a los científicos aumentar la eficiencia a través de sus flujos de trabajo.

El micromuestra se coloca directamente en la parte superior de la superficie de detección y una columna de líquido se crea entre los extremos de las fibras ópticas por la tensión superficial. Esta columna de líquido forma un camino óptico vertical. Un flash de xenón lámpara proporciona la fuente de luz y un espectrómetro de la utilización de una matriz CCD se utiliza para analizar la luz que pasa a través de la muestra.

La eliminación de los dispositivos tradicionales de contención tales como cubetas del sistema tiene varias ventajas: cantidades muy pequeñas de muestra son necesarios para la medición, la limpieza requiere simplemente limpiar las superficies ópticas con un laboratorio de limpiar, y la longitud del camino se pueden cambiar en tiempo real durante la medición.

El 2000c NanoDrop determina la longitud del camino óptimo de forma automática (1 mm y 0,05 mm), proporcionando la más amplia gama de posibles mediciones de concentración de proteínas sin diluciones. Al acortar la longitud del camino, la mayor concentración de proteínas se puede medir. Esto elimina la necesidad de realizar las diluciones de las muestras más proteínas. Por ejemplo, el 2000c NanoDrop puede medir las concentraciones de BSA de hasta 400 mg / mL.

El NanoDrop 2000c espectrofotómetro es un espectrofotómetro de espectro completo para medir la absorción de ADN, el ARN, proteínas y otras biomoléculas. Este protocolo de vídeo se centrará en la medición de las proteínas.

II. Concentración de proteínas microvolumen determinación usando mediciones de absorbancia A280

a. Principio de las mediciones A280

El método A280 proteína es aplicable a las proteínas purificadas que contienen triptófano, los residuos de tirosina, fenilalanina o cisteína, enlaces disulfuro y la absorbencia muestra a 280 nm. Este método utiliza el valor de absorbancia A280 en combinación con el coeficiente de extinción en masa o el coeficiente de extinción molar para calcular la concentración de la proteína purificada. La ventaja de las mediciones directas A280 es que la generación de una curva patrón no está obligado a determinar la concentración de proteína. Si la muestra es una solución de proteína no caracterizada, lisado de células, o extracto de proteína cruda, a continuación, utilizando uno de los métodos colorimétricos preconfigurados disponibles en el 2000/2000c NanoDrop, como BCA, Pierce 660 nm, Bradford, Lowry y los ensayos, es recomienda.

b. Microvolumen proteína A280 Medidas - Inicio

  1. Seleccione la aplicación A280 de proteínas en el menú principal.
  2. Seleccione el tipo de muestra a analizar de la lista desplegable. La configuración por defecto se recomienda para la mayoría de mezclas de proteínas desconocidas en el que una Abs = 1 mg / ml. Si la medición de una proteína previamente caracterizada purificada, o bien el coeficiente de extinción en masa o coeficiente de extinción molar y el peso molecular puede ser ingresado para determinar la concentración de proteínas con mayor precisión.
  3. Elija las unidades de concentración de la lista desplegable.

c. Microvolumen y proteínas A280 - Supresión

  1. Establecer un blanco con un tampón apropiado. Es importante utilizar el buffer en el que se suspende la proteína. El tampón utilizado debe ser el mismo pH y de una fuerza similar iónicos como la solución de la muestra. Nota: buffers RIPA absorbancia contribuir mucho a 280 nm y por lo tanto, incompatible con las mediciones directas A280 proteínas. Para las proteínas en suspensión en un tampón RIPA, se recomienda la concentración de proteínas se determinó utilizando un buffer RIPA ensayo colorimétrico compatible.
  2. Pipetear 2 l de la solución apropiada de cierre en la parte inferior del pedestal, bajar el brazo y haga clic en blanco.
  3. Limpie la solución en blanco de los pedestales superior e inferior con un laboratorio de limpieza en seco.

d. Microvolumen y proteínas A280 de medición

Consideraciones importantes: La homogeneidad de la muestra es muyimportante, ya que un volumen tan pequeño que se está midiendo. Para asegurar que las muestras son homogéneas, suavemente pero a fondo la mezcla de las muestras inmediatamente antes de tomar una alícuota para la medición. Evitar la introducción de burbujas durante el mezclado y la pipeta.

Debido a la variabilidad de la tensión superficial entre las proteínas diferentes, le recomendamos que cargue 2 l de las muestras para asegurar la formación adecuada columna. Utilice siempre puntas de pipeta de baja retención. Para cargar una muestra, toque la punta de la pipeta a la superficie del pedestal óptica inferior, mientras que la expulsión de la solución para evitar que la solución se adhiera a la parte exterior de la punta de la pipeta. Expulsar a menos que el monto total de la muestra para evitar que escape y la introducción de burbujas en la muestra.

  1. Introduzca una identificación de la muestra en el campo apropiado, carga de 2 l de la primera muestra como se describe en la medida en blanco y haga clic en. Una alícuota de la muestra 2μL se debe utilizar para cada medición.
  2. Retire la muestra de los pedestales superior e inferior con un laboratorio de limpieza en seco.

e. Microvolumen proteína A280 Medidas de limpieza

Una ordinaria y sin pelusa, limpie de laboratorio a menudo es suficiente para la limpieza de los pedestales óptica entre las mediciones.

f. Hacer proteína A280 Medidas de reacondicionamiento

Soluciones y reactivos que contienen surfactantes pueden sin condiciones de las superficies del pedestal de medición a través del tiempo, la prevención de la columna de líquido de la muestra a la forma. Un aplanamiento de la gota en el pedestal más bajo es indicativo de la superficie óptica convirtiendo incondicionado. Si las propiedades de superficie han sido comprometidos, reacondicionamiento de los pedestales es importante para asegurar la formación de la muestra de la columna. Si esto ocurre, aficionado a las superficies ópticas con fuerza el uso de laboratorio o eliminar el uso de pedestal compuesto NanoDrop reacondicionamiento (PR-1) como se indica.

III. Concentración de proteínas microvolumen determinación sobre ensayos colorimétricos

a. Principio de detección colorimétrica

El espectrofotómetro NanoDrop 2000c también se puede utilizar para medir caracterizados soluciones de proteínas, lisados ​​celulares, y los extractos de proteína cruda mediante ensayos colorimétricos.

Los métodos colorimétricos son métodos indirectos que implican la interacción de un medio de contraste con el componente de las proteínas de la muestra para producir un nuevo complejo que absorbe la luz en el rango de longitudes de onda visibles.

El espectrofotómetro NanoDrop 2000c tiene varios pre-configurados ensayos colorimétricos como BCA, Pierce 660, Bradford, y los métodos de Lowry. El ensayo de BCA se demostrará como un ensayo colorimétrico ejemplo usando un espectrofotómetro microvolumen. (Screenshot)

El BCA (ácido bicinconínico) ensayo es un método común colorimétrico de uso frecuente para las soluciones de proteínas diluidas y las proteínas en la presencia de componentes que han UV significativa (280 nm) la absorbancia. A diferencia del método A280 de proteínas, el método de BCA Protein requiere que una curva estándar se genera antes de que las concentraciones de la proteína de la muestra se puede medir.

El método utiliza el ácido bicinchoninic (BCA) como reactivo de detección. El quelato Cu-BCA se formaron en presencia de la proteína se mide a 562 nm y normalizado a 750 nm.

b. Microvolumen ensayo BCA mediciones BCA ensayo de preparación

  1. Los componentes necesarios están contenidos en el kit de agente reductor compatible (Thermo Scientific Pierce gato no 23250..): BCA reactivo A, B BCA reactivo, el reactivo de compatibilidad, la reconstitución de amortiguación, y la albúmina (BSA) las normas.
  2. Equilibrar todas las proteínas desconocidas y las normas de la proteína a la temperatura ambiente y mezclar bien.
  3. Prepare suficiente reactivo nuevo trabajo de los estándares y las muestras que se midió utilizando una proporción de 50:1 de reactivo A: B
  4. Para el ensayo de micro, utilice una proporción de 1:1 de reactivo de trabajo a la muestra. Añadir 10 l de reactivo de trabajo a cada tubo con tubos lo suficiente para cubrir todas las muestras y estándares. Para el ensayo de alto rango, utilice una proporción de 20:1 de reactivo de trabajo a la muestra. Añadir 190 l de reactivo de trabajo a cada tubo con tubos lo suficiente para cubrir todas las muestras y estándares. Se refieren a la Pierce BCA kit literatura para determinar la relación es adecuada para sus muestras.
  5. Añadir 10 l de estándar o muestra a cada tubo con el reactivo. Mezclar bien por agitación suave.
  6. Incubar los tubos a 37 ° C durante 30 minutos.
  7. Permiten que las reacciones estén a temperatura ambiente (~ 10 minutos).

c. Microvolumen BCA Las mediciones del ensayo La generación de la curva estándar

  1. Seleccione el método de BCA Protein desde el menú principal. Si la ventana de verificación de la longitud de onda aparece, asegúrese que el brazo hacia abajo.
  2. Introduzca los valores para cada concentración de patrón en la mesa panel de la derecha. El software permite la referencia y adic hasta 7normas ional. La referencia y / o las normas se debe medir en repeticiones.
    Nota: El requisito mínimo para la generación de la curva estándar es la medida de dos normas o la medición de la referencia estándar de cero y al menos uno. Se recomienda que las normas adicionales se incluye como necesario para cubrir el rango del ensayo concentración esperada.
  3. Establecer un espacio en blanco. El espacio en blanco para los ensayos colorimétricos generalmente desionizada H 2 O.
  4. Pipetear 2 l de dH 2 O en el pedestal inferior, baja el brazo y haga clic en blanco. Un testigo sólo es necesario para cubrir todas las mediciones posteriores de la referencia y las normas.
  5. Establecer la referencia con la pipeta una alícuota de 2 l que contiene sólo reactivo de trabajo y el tampón con ninguna proteína en el pedestal inferior. Baje el brazo y la medida haga clic.
  6. En la ficha Normas, seleccione el nivel deseado y l pipeta 2 de la norma que desee en el pedestal inferior. Baje el brazo y la medida haga clic. Repita el proceso para todos los niveles. Asegúrese de medir todas las normas anteriores a la medición de las muestras. Para ver la curva de calibración haga clic en Ver la curva estándar.

d. Microvolumen BCA mediciones Ensayo 2 y proteínas l

  1. Después de todas las normas se han medido, haga clic en el botón de muestras. Introduzca la identificación de la muestra. Carga de 2 l de la muestra en el pedestal inferior y haga clic en Medida. Un fresco 2 l alícuota de la muestra se debe utilizar para cada medición.
  2. Limpie la muestra de los pedestales superior e inferior con un laboratorio de limpieza en seco.

e. Microvolumen mediciones de ensayo BCA Limpieza y Reacondicionamiento

Realizar la limpieza y el reacondicionamiento como se describe en las mediciones de absorbancia directa A280.

Los resultados representativos:

Microvolumen determinación de la concentración de proteínas se lleva a cabo ya sea por un A280 de medición directa o indirecta de un ensayo colorimétrico. En el ejemplo de la medición A280 determina la concentración de proteínas basado en el coeficiente de extinción de la proteína de interés. En el ejemplo de BCA ensayo colorimétrico que determina la concentración de proteínas basado en una curva estándar de las concentraciones de proteína conocida.

Discussion

Cuantificación microvolumen utiliza las propiedades de la superficie de la tensión intrínseca de una muestra para formar una columna de líquido entre dos superficies de medición. La ausencia de un dispositivo de contención, permite a la longitud del camino para cambiar en tiempo real, básicamente eliminando la necesidad de realizar diluciones. Esta capacidad aumenta considerablemente el rango dinámico de las concentraciones de proteínas, así como la velocidad de medición. Mediante el uso de cantidades mínimas de muestra, un gran número de muestras pueden ser analizadas de forma rápida y precisa, permitiendo a los científicos para tomar más medidas y lograr un mejor control de calidad. Además, y si es necesario, las muestras de preciosos pueden ser recuperados después de tomar una medida. Cuando tales volúmenes pequeños se están midiendo, homogeneidad de la muestra es muy importante para evitar errores de muestreo. Puntas de pipeta de baja retención siempre se debe utilizar para cargar las muestras y las puntas se debe cambiar entre la muestra repeticiones. Las superficies de pedestal debe ser limpiado y acondicionado para asegurar los resultados más precisos. Por último, el espectrofotómetro microvolumen es ideal cuando la muestra es limitado, sin embargo, la facilidad de uso, velocidad y amplia gama dinámica del espectrómetro lo hacen adecuado cuando la muestra es abundante.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

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References

  1. Aitken, A., Learmonth, M. Protein determination by UV absorption. (1996).
  2. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  3. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
  4. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
  5. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. (2006).
  6. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. ujimoto, Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  7. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).
Concentración de proteínas microvolumen Determinación mediante el NanoDrop 2000c Espectrofotómetro
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Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

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