Biology

Murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से hematopoietic स्टेम सेल की व्युत्पत्ति

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/162

Shannon McKinney-Freeman¹, George Daley¹

¹Childrens Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

यह प्रोटोकॉल transplantable माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) और उनके lethally विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों में बाद इंजेक्शन से hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की व्युत्पत्ति विवरण. संक्षेप में, ईएससी embryoid निकायों, जो तब रेट्रोवायरल HoxB4 और OP9 stromal कोशिकाओं और hematopoietic साइटोकिन्स के साथ सह - सुसंस्कृत से संक्रमित कर रहे हैं के रूप में भेदभाव कर रहे हैं.

Abstract

एक स्टेम सेल क्षमता के साथ एक के लिए सेल के रूप में परिभाषित किया गया है दोनों आत्म नवीनीकृत और कई विभेदित संतान उत्पन्न. भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) जल्दी भ्रूण के ब्लास्टोसिस्ट से प्राप्त कर रहे हैं और differentiative क्षमता में pluripotent रहे हैं. उनके विशाल differentiative संभावित उन्हें बहुत कैसे उन्हें मनाना करने के लिए चिकित्सकीय उपयोगी सेल प्रकार उत्पन्न deducing पर केंद्रित शोध का ध्यान केंद्रित किया है. माउस ईएससी से hematopoietic स्टेम सेल HSC () के सफल व्युत्पत्ति हाल ही में पूरा किया गया है और इस वीडियो प्रोटोकॉल में visualized किया जा सकता है. HSC, यकीनन सबसे चिकित्सकीय शोषण सेल की आबादी, असंख्य hematopoietic दुर्दमताओं और विकारों के इलाज के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि, कई रोगियों है कि HSC चिकित्सा से लाभ हो सकता है उपयुक्त दाताओं के लिए उपयोग की कमी है. ईएससी इन रोगियों के लिए एक HSC के वैकल्पिक स्रोत प्रदान कर सकता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक आधारभूत जिसमें से ESC HSC और अध्ययन मानव ईएससी से HSC अलग करने के प्रयासों को सूचित किया जा सकता है स्थापित करता है. इस प्रोटोकॉल में, ईएससी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीरम के लिए पूर्व जांच इष्टतम hematopoietic भेदभाव में 6 दिनों के लिए embryoid निकायों (ईबीएस) के रूप में भेदभाव कर रहे हैं. ईबीएस तो dissociated और रेट्रोवायरल HoxB4 से संक्रमित हैं. चूहों, और hematopoiesis की उपस्थिति में दस दिनों के लिए साइटोकिन्स को बढ़ावा देने के सह सुसंस्कृत - संक्रमित EB-व्युत्पन्न कोशिकाओं OP9 stroma, एक अस्थि मज्जा stromal सेल एम-CSF / calvaria से व्युत्पन्न लाइन पर चढ़ाया जाता है. इस सह - संस्कृति के दौरान, संक्रमित कोशिकाओं को काफी विस्तार, पीढ़ी में कोशिकाओं के लाखों लोगों के 100s के एक विषम पूल परिणामस्वरूप. इन कोशिकाओं को तो बचाव और reconstitute lethally विकिरणित चूहों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव

ईएससी trypsin के साथ उपचार के माध्यम से भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) के एक के पास मिला हुआ फ्लास्क लीजिए.
भेदभाव मीडिया के 5 एमएल में कोशिकाओं Resuspend और एक गैर जिलेटिन लेपित T25 करने के लिए स्थानांतरण. 37 में सेते ° C 45 मिनट के लिए. सतह पर तैरनेवाला पुनर्प्राप्त और centrifugation के माध्यम से कोशिकाओं को इकट्ठा.

नोट: माउस ईएससी संस्कृतियों से भ्रूण fibroblasts (MEFs) गैर जिलेटिन लेपित T25 आसानी से देते हैं और इस तरह इस चढ़ाना चरण के दौरान संस्कृति से समाप्त . यदि आप MEFs पर आपके ईएससी संवर्धन नहीं कर रहे हैं, आप पूर्व की थाली छोड़ सकते हैं.
Resuspend MEF समाप्त 333,333 cells/50 एमएल पर भेदभाव मीडिया में ESC. यह एकाग्रता 100 ESC/15 एमएल में परिणाम है.
Pipettor का उपयोग मल्टी चैनल, 100 cells/15 15 सेमी ² पेट्री प्लेटों पर एमएल ड्रॉप पर थाली ईएससी. एक 8 - चैनल pipettor के साथ, आप प्लेट प्रति बूंदों के 18-22 पंक्तियों (5ml प्लेट प्रति के बारे में) के बारे में फिट करने में सक्षम होना चाहिए.

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, बूंदों के 2-5 15 ² सेमी व्यंजन पर्याप्त से अधिक हो सकता है और 2-5 x 10 ^दिन 6 छह EB-व्युत्पन्न कोशिकाओं उपज चाहिए .
धीरे प्लेटें फ्लिप करने बूँदें पलटना. 48 घंटे के लिए ° 5 _सी% सीओ 2 37 सेते हैं .
पूल धीरे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब घूमता प्लेटें और हस्तांतरण द्वारा बूँदें. पीबीएस के 4-6 एमएल के साथ प्लेटें कुल्ला और एक ही 15 एमएल शंक्वाकार जोड़ें.

नोट: आप पाँच फांसी ड्रॉप प्लेटें पूल हो सकता है. ईबीएस है के रूप में वे करने के लिए अंतर जारी है और अगर वे भी केंद्रित कर रहे हैं वे बड़े फार्म clumps करते हैं विकसित होगा.
जमा ईबीएस गुरुत्व (10 मिनट के बारे में) द्वारा व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें. ईबीएस परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला Aspirate. धीरे 10 एमएल भेदभाव मीडिया और 10 सेमी गैर पक्षपाती पेट्री प्लेट करने के लिए स्थानांतरण में resuspend है.
प्लेस पर पेट्री थाली थाली प्रकार के बरतन पर 50 और 37 पर rpm सेते ° 5 सी% सीओ _2.
24 घंटे बाद (भेदभाव के चार दिन), भंवर प्लेटें पेट्री डिश के केंद्र में ईबीएस ध्यान केंद्रित करने के लिए. ध्यान मुद्रा 5 एमएल ताजा भेदभाव मीडिया के साथ मीडिया के 50% (5 एमएल). इनक्यूबेटर करने के लिए दो दिन के लिए थाली लौटें.

MSCV HoxB4 - IRES GFP साथ EB हदबंदी और संक्रमण

भेदभाव के छह दिन, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब ईबीएस हस्तांतरण. गंभीरता से व्यवस्थित करने की अनुमति दें.
10 एमएल पीबीएस में मीडिया और resuspend Aspirate. ईबीएस गंभीरता से बसने की अनुमति दें. Aspirate पीबीएस.
250 एमएल हदबंदी एंजाइम मिश्रण और 1 एमएल पीबीएस जोड़ें. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं, कभी कभी ट्यूब घूमता एंजाइमों और ईबीएस मिश्रण.
8 एमएल एंजाइम मुक्त पृथक्करण बफर जोड़ें.
मिश्रण 5 एमएल पिपेट का उपयोग कर जब तक ईबीएस पूरी तरह से अलग हैं (, अत्यधिक pipetting EB-व्युत्पन्न सेल तैयारी के भीतर मौत में वृद्धि होगी के बारे में 10 बार) Triturate.
1. मिश्रण के रूप में ईबीएस अलग कर देना कोशिकाओं के साथ बादल बन जाएगा.
2. Trituration दौरान शंक्वाकार ट्यूब के नीचे के खिलाफ विंदुक टिप रखकर एक कतरनी बल है कि बहुत पृथक्करण सुविधा होगी पैदा करेगा.
Centrifugation के माध्यम से कोशिकाओं को ले लीजिए.
Resuspend कोशिकाओं EB 10% के 5 एमएल IMDM में व्युत्पन्न और trypan नीले बहिष्करण का उपयोग गिनती

नोट: भेदभाव के चार और छह दिन पर दिन के बीच, ईबीएस cavitate जो apoptosis और सेल death.Thus की एक बड़ी राशि में परिणाम है, दिन में छह, EB-व्युत्पन्न कोशिकाओं के 30% के ऊपर trypan नीले रंग के साथ दाग सकता है .
कोशिकाओं 100,000 कोशिकाओं को व्युत्पन्न Resuspend EB / 2 के एमएल 10% IMDM + वायरल सतह पर तैरनेवाला ऐसी है कि एक 5-10 के MOI 8 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए protamine सल्फेट achieved.Add है.

नोट: चार 6 अच्छी तरह प्लेटें (2 एमएल / अच्छी तरह से संभालने) थाली करने के लिए पर्याप्त EB / वायरल सतह पर तैरनेवाला मिश्रण तैयार करें .
प्लेट 2 एमएल / EB वायरल सतह पर तैरनेवाला के प्रति अच्छी तरह से मिश्रण चार 6 OP9 stroma कोशिकाओं (नीचे देखें) के साथ अच्छी तरह से पूर्व चढ़ाया प्लेटें.
90 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2500 rpm पर प्लेटें अपकेंद्रित्र. इनक्यूबेटर करने के लिए 37 पर प्लेटें स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस 5% सीओ _2.
4-6 घंटे बाद, प्लेटों से सतह पर तैरनेवाला फसल और किसी भी संभावित centrifugation के माध्यम से निलंबन में शेष कोशिकाओं को इकट्ठा.
Resuspend (छोटा हो सकता है) 48 एमएल 10% IMDM में गोली + साइटोकिन्स. एमएल बांटना 2 / अच्छी तरह से मूल 6 अच्छी तरह से चार प्लेटों में जो संक्रमण प्रदर्शन किया और सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था करने के लिए resuspension.

नोट: हमेशा 10% IMDM + साइटोकिन्स उपयोग के समय में ताजा तैयार.
37 में सात दिनों के लिए ° 5 सी% सीओ ₂ प्लेटों का सेते हैं . कालोनियों दिन चार के बाद संक्रमण और बड़े और सात दिन के द्वारा अच्छी तरह से बनाई द्वारा स्पष्ट किया जाना चाहिए. एक मजबूत विस्तार / सात दिन पर अच्छी तरह से 40-60 कालोनियों उपज चाहिए.
दिन सात पोस्ट संक्रमण पर जमा है, और पूल trypsin के साथ इलाज के द्वारा सभी कुओं से सभी कक्षों (OP9 stroma सहित).

नोट: सतह पर तैरनेवाला या नहीं washes पीबीएस trypsin संस्कृति में इस बिंदु treatment.At के दौरान कार्यरत त्यागें, कुछ कालोनियों केवल शिथिल पक्षपाती हो सकता है और वहाँ कई कोशिकाओं रहे हैं floasuspension.Collect और पूल सभी washes और सतह पर तैरनेवाला में ting सुनिश्चित करने के लिए कि कोई भी संभावित मूल्यवान कोशिकाओं को खारिज कर रहे हैं.
8 एमएल ताजा 10% IMDM में Resuspend कोशिकाओं + साइटोकिन्स. चार T75 बोतल में 2 MLS / फ्लास्क बांटो. प्रत्येक कुप्पी के लिए एक अतिरिक्त 13 MLS 10% IMDM + साइटोकिन्स जोड़ें. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस 5% तीन दिनों के लिए सीओ ₂ (दस दिनों के बाद संक्रमण के एक कुल).

संस्कृति और OP9 stroma के चढ़ाना

20 एक सदस्य% में मानक प्रोटोकॉल के अनुसार stroma OP9 बनाए रखें. OP9 कोशिकाओं के गुणों में परिवर्तन जब confluency हो जाएगा. हमेशा 1:03 से अधिक नहीं विभाजन पर 80 confluency% पर विभाजित है.
दिन MSCV - HoxB4 - IRES-GFP, थाली 25,000 / 20% एक सदस्य में चार छह अच्छी तरह से प्लेटों की अच्छी तरह से OP9 कोशिकाओं के साथ छह EB-व्युत्पन्न कोशिकाओं के संक्रमण से पहले 24 घंटे.

संग्रह fractionation, और प्रत्यारोपण

Trypsin के साथ उपचार के माध्यम से दस दिनों के लिए OP9 stroma पर विस्तार कोशिकाओं ले लीजिए. कोशिकाओं की गणना.

नोट: सतह पर तैरनेवाला या पीबीएस त्यागें नहीं trypsin उपचार के दौरान कार्यरत washes . संस्कृति में इस बिंदु पर, कुछ कालोनियों केवल शिथिल पक्षपाती हो सकता है और वहाँ कई suspension.Collect और पूल में सभी washes और सतह पर तैरनेवाला करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई भी संभावित मूल्यवान कोशिकाओं को खारिज कर रहे हैं तैर कोशिकाओं रहे हैं हो सकता है.

नोट: एक अच्छा विस्तार 40-50 x 10 ⁶ कोशिकाओं / मूल 6 अच्छी तरह से संक्रमित प्लेट के बीच 160-200 x ¹⁰ 6 कोशिकाओं की कुल के लिए, उपज चाहिए.
कक्ष चुंबकीय मनका चयन या प्रोटोकॉल में इस बिंदु पर मानक तकनीक के अनुसार FACS के माध्यम से fractionated हो सकता है.
प्रत्यारोपण के लिए, Rag-2/gc कमी (15-22 ग्राम के बीच वजन) प्राप्तकर्ताओं विकिरण 2.5 बजे 9.25 gy के एक विभाजन खुराक के अधीन रेट्रो कक्षीय या पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से कोशिकाओं देने. अलग.

नोट: यह महत्वपूर्ण है कि जानवरों के वजन के विकिरण के समय 15-22 ग्राम के बीच गिरावट है. अगर वे 22 ग्राम से बड़े होते हैं, 9.25 gy विकिरण की एक पर्याप्त खुराक नहीं हो उपयुक्त पृथक सुनिश्चित करने और कोशिकाओं घातक विकिरण और / या hematopoietic डिब्बे टीका लगाना से बचाव नहीं मध्यस्थता कर सकते हैं . यदि बड़े जानवरों रोपाई, उचित विकिरण खुराक प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए.
2-5 x 10 ⁶ कोशिकाओं / पशु का एक न्यूनतम खुराक घातक विकिरण से बचाव की गारंटी की आवश्यकता है. यदि कोशिकाओं fractionating, 2-5 x 10 ⁶ सेल समकक्ष (जैसे अगर ब्याज की जनसंख्या कक्षों की unfractionated पूल के 10% का प्रतिनिधित्व करता ^है, 2-5 x 10 5 कोशिकाओं / पशु इंजेक्षन ) इंजेक्षन.

नोट: यदि> 2 इंजेक्शन x 10 ⁶ कोशिकाओं, हमेशा पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्षन करने के लिए कक्षा, जो जब कोशिकाओं की उच्च संख्या रेट्रो orbitally वितरित कर रहे हैं परिणाम हो सकता है में teratoma गठन से बचने के.
बनाए रखें 2 - चीर ^{- / / -} / gc autoclaved पिंजरों में कमी प्राप्तकर्ताओं. जानवरों की सुविधा के "सफाई" पर निर्भर करता है, के बाद प्रत्यारोपण पशुओं acidified पानी या Trimethiprim Sulfasoxazole (Septra) की घातक विकिरण के बाद 5 हफ्तों के लिए प्रशासन की आवश्यकता हो सकती है.
परिधीय रक्त में 3 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण में> 90% GFP + ES - व्युत्पन्न leukocytes की अपेक्षा करें. बहु - वंश engraftment हो सकता है, हालांकि लिम्फोसाइटों रेट्रोवायरल HoxB4 IRES GFP चुप्पी के लिए जाना जाता है चाहिए.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc