Biology

Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/162

Shannon McKinney-Freeman¹, George Daley¹

¹Childrens Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

Этот протокол детали вывода трансплантации гемопоэтических стволовых клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и их последующей закачки в смертельно облученных мышей получателя. Короче говоря, ЭСК дифференцируются эмбриоидных органов, которые затем инфицированных ретровирусных HoxB4 и со-культивировали с OP9 стромальные клетки и гемопоэтические цитокины.

Abstract

Стволовых клеток определяется как клетка с возможностью как самостоятельного обновления и создавать несколько дифференцированных потомства. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из бластоцист из раннего эмбриона и плюрипотентные в differentiative способности. Их огромный потенциал differentiative сделало их центром внимания для большого исследования сосредоточены на выведении как уговорить их для создания клинически полезным типов клеток. Успешный вывод гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) из мышиных ЭСК было недавно достигнуто, и могут быть визуализированы в этом видео протокол. HSC, пожалуй, наиболее клинически эксплуатируемые популяции клеток, которые используются для лечения множества злокачественных опухолей кроветворной и расстройств. Тем не менее, многие пациенты, которые могли бы извлечь выгоду из HSC терапии не имеют доступа к подходящих доноров. ESC может обеспечить альтернативный источник HSC для этих пациентов. Следующий протокол устанавливает исходных линий, от которых ESC-HSC можно изучать и в усилиях по изоляции HSC из человеческих ЭСК. В этом протоколе, ESC, дифференцируются как эмбриоидных тел (ЭТ) в течение 6 дней в коммерчески доступных сыворотки предварительно отобранных для оптимального гемопоэтических дифференциации. ЭТ затем диссоциирован и инфицированных ретровирусных HoxB4. Зараженные EB-клеток, полученных из высевали на OP9 стромы, стромы костного мозга клеточной линии происходит от черепа М-CSF-/ - мышей, и ко-культивировали в присутствии органов кроветворения содействия цитокинов в течение десяти дней. Во время этого совместного культуры, инфицированных клеток значительно расширить, в результате чего поколения гетерогенных пул 100s из миллионов клеток. Эти клетки затем можно использовать, чтобы спасти и восстановить смертельно облученных мышей.

Protocol

Дифференциация эмбриональных стволовых клеток

Сбор возле сливающийся колбу эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) с помощью лечения ESC трипсина.
Ресуспендируют клетки в 5 мл Дифференциация средств массовой информации и передачи не-желатин покрытием T25. Инкубировать при 37 ° С в течение 45 минут. Получить супернатант и сбора клеток с помощью центрифугирования.

Примечание: мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) из культур ESC придают готовностью без желатина покрытием T25 и, таким образом истощаются от культуры в течение этого покрытия шаг. Если вы не культивирование ваш регулятор на MEFs, вы можете пропустить предварительно пластину.
Ресуспендируют MEF-обедненного ESC в Дифференциация средств массовой информации на 333333 cells/50 мл. Эта концентрация приводит к 100 ESC/15 мл.
Использование многоканальных дозаторов, плиты ESC на 100 мл cells/15 падение на 15 см ² чашках Петри. С 8-канальная пипетка, вы должны быть в состоянии соответствовать примерно 18-22 строк капель на чашку (около 5 мл на чашку).

Примечание: этот протокол, 2-5 15 см ² блюда капель будет более чем достаточно, и должно дать 2-5 х 10 ⁶ день шесть EB-клеток, полученных из.
Аккуратно переверните пластин, чтобы инвертировать капель. Инкубировать при 37 ° C 5% CO ₂ в течение 48 часов.
Бассейн капли, осторожно закрученного пластин и передача до 15 мл коническую трубку. Промыть пластины с 4-6 мл ФСБ и добавить в те же 15 мл коническую.

Примечание: Вы можете бассейн до пяти пластин висят капли. ЭТ будет расти, поскольку они продолжают дифференцироваться и если они слишком сосредоточены они, как правило, образуют большие скопления.
Разрешить объединенных ЭТ урегулировать под действием силы тяжести (около 10 минут). Аспирируйте супернатант, не нарушая EBS. Аккуратно ресуспендируют в 10 мл Дифференциация средств массовой информации и передачи до 10 см не соблюдают чашку Петри.
Место Петри пластины на пластину шейкере при 50 оборотах в минуту и инкубировать при температуре 37 ° C 5% CO _2.
Через 24 часа (четвертый день дифференциации), вихрем пластин сосредоточиться ЭТ в центре чашки Петри. Тщательно обмен 50% средств массовой информации (5 мл) 5 мл свежего СМИ дифференциация. Вернуться пластину инкубаторе в течение еще двух дней.

Е. Б. диссоциации и инфицирования MSCV-HoxB4-IRES-GFP

На шестой день дифференциации, передачи ЭТ до 15 мл коническую трубку. Разрешить урегулировать под действием силы тяжести.
Аспирируйте СМИ и ресуспендируют в 10 мл PBS. Разрешить ЭТ переселиться под действием силы тяжести. Аспирируйте PBS.
Добавить 250 мл смеси диссоциации фермента и 1 мл PBS. Инкубируйте в 37 ° С водяной бане в течение 20 минут, время от времени закрученной трубки для смешивания ферментов и EBS.
Добавить 8 мл фермента без диссоциации буфера.
Растирают смесь, используя 5 мл пипетки до ЭТ полностью диссоциированных (около 10 раз; чрезмерное пипетирования увеличится смерти в течение EB-производные подготовки клетки).
1. Смесь будет облачно с клетками как ЭТ диссоциируют.
2. Размещение пипетки против нижней конической трубе при растирании создаст поперечной силы, что значительно облегчит диссоциации.
Сбор клеток с помощью центрифугирования.
Ресуспендируют EB-клеток, полученных в 5 мл 10% IMDM и считать с трипановым синим исключения

Примечание: Между четвертый день и день шесть дифференциации, ЭТ cavitate в результате чего большое количество апоптоза и клеточной death.Thus, на шестой день, свыше 30% EB-клеток, полученных могут испачкать с трипанового синий.
Ресуспендируют EB-клеток, полученных на 100 000 клеток / 2 мл 10% IMDM + вирусный супернатант, что МВД является 5-10 achieved.Add протаминсульфат до конечной концентрации 8 мг / мл.

Примечание: Подготовьте достаточно EB / вирусного супернатанта микс на пластине четыре 6-луночных планшетах (при условии, 2 мл / лунку).
Пластина 2 мл EB / вирусного супернатанта смеси на скважине четыре 6-луночных предварительно покрыты OP9 клетки стромы (см. ниже).
Центрифуга пластин при 2500 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 90 минут. Передача пластин в инкубатор при 37 ° C 5% CO _2.
4-6 часа спустя, урожай супернатант из плит и собирать любые потенциальные клетки, остающиеся в виде суспензии с помощью центрифугирования.
Ресуспендируют гранул (может быть небольшим) в 48 мл 10% IMDM + цитокинов. Внесите 2 мл / лунку ресуспендирования на оригинальные четыре 6-луночных планшетах, в которых инфекция была выполнена и Супернатант собирают.

Примечание: Всегда готовьте 10% IMDM + цитокинов свежей во время использования.
Инкубируйте пластин при 37 ° C 5% CO ₂ в течение семи дней. Колонии должно быть очевидно, на четвертый день после инфекции и большой и хорошо образованной день семь. Надежная расширение должно дать 40-60 колоний / хорошо на седьмой день.
На седьмой день после заражения, собирать и объединять все клетки (в том числе OP9 стромы) из всех скважин путем обработки трипсином.

Примечание: Не выбрасывайте супернатанта или PBS моет, используемой при трипсина treatment.At данный момент в культуре, некоторые колонии могут быть только свободно присоединенными и Есть много клеток floaTing в suspension.Collect и бассейн все моет и супернатант обеспечить, чтобы ни потенциально ценные клетки удаляются.
Ресуспендируют клеток в 8 мл свежей 10% IMDM + цитокинов. Распространение 2 мл / флакон на четыре T75 колб. Добавить еще 13 мл 10% цитокинов IMDM + для каждой колбе. Инкубировать при 37 ° C 5% CO ₂ в течение трех дней (в общей сложности десять дней после инфекции).

Культура и обшивки OP9 стромы

Поддерживать OP9 стромы в соответствии со стандартными протоколами в 20%-MEM. OP9 клетки изменяют свои свойства при выращивании до слияния. Всегда разделяются на 80% слияния не более чем в 1:03 раскол.
24 часа до заражения шестой день EB-клеток, полученных с MSCV-HoxB4-IRES-GFP, плиты OP9 25000 клеток / лунку из четырех 6-луночных планшетах в 20%-MEM.

Сбор, фракционирования и трансплантации

Сбор клетки расширил OP9 стромы в течение десяти дней по лечению трипсином. Граф клеток.

Примечание: Не выбрасывайте супернатанта или PBS моет, применяемого при лечении трипсина. На данный момент в культуре, некоторые колонии могут быть только свободно присоединенными и Есть много клеток, плавающих в бассейне suspension.Collect и все моет и супернатант обеспечить, чтобы ни потенциально ценные клетки удаляются.

Примечание: хорошее расширение должно доходности между 40-50 х 10 ⁶ клеток / оригинальной 6-луночный планшет инфицированных, в общей сложности 160-200 х 10 ⁶ клеток.
Ячейки могут быть фракционированный через магнитный шарик выбора или FACS согласно стандартным методикам на данный момент в протокол.
Для трансплантации, доставлять клетки с помощью ретроорбитального или хвост инъекции вену Rag-2/gc недостаточно получателей (весом от 15-22 грамм) подвергается раскол дозы 9,25 Гр облучения 2,5 часа. друг от друга.

Примечание: Очень важно, чтобы вес животных находятся между 15-22 граммов на момент облучения. Если они превышают 22 грамм, 9,25 Гр не будет достаточной дозы облучения для обеспечения надлежащей абляции и клетки не могут опосредовать спасти от смертельного облучения и / или прививать гемопоэтических отсека. Если пересадка более крупные животные, соответствующую дозу облучения должны быть определены экспериментально.
Минимальная доза в 2-5 х 10 ^{6 клеток} / животное обязано гарантировать спасение от смертельной радиации. Если фракционирования клеток, вводят 2-5 х 10 ^{6-элементной} эквиваленты (например, если население интерес представляет 10% от нефракционированного пула клеток, вводят 2-5 х 10 ⁵ клеток / животное).

Примечание: Если инъекционных> 2 х 10 ^{6 клеток,} ВСЕГДА вводят через хвостовую вену, чтобы избежать тератома формирование на орбите, которая может привести, когда большое число клеток поставляются ретро-орбитально.
Поддерживать Rag-2 ^{- / - /} дс ^{- / -} дефицитный получателей в автоклаве клеток. В зависимости от "чистоты" животного объект, после трансплантации животным может потребоваться администрации водой, подкисленной или Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) за 5 недель после смертельной радиации.
Ожидайте> 90% GFP + ES-производных лейкоцитов в периферической крови через 3 недели после трансплантации. Приживления должна быть мульти-линии, хотя и лимфоциты, как известно, молчание ретровирусных HoxB4-IRES-GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc