Biology

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

Published: February 25, 2007 doi: 10.3791/162

Shannon McKinney-Freeman¹, George Daley¹

¹Childrens Hospital, Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School

Summary

Detta protokoll detaljer härledning av transplanterbara hematopoetiska stamceller från mus embryonala stamceller (ESC) och den efterföljande injektion i dödligt bestrålade mottagaren möss. Kortfattat är ESC differentierade som embryoid organ, som sedan är infekterade med retrovirus HoxB4 och co-odlade med OP9 stromaceller och hematopoetisk cytokiner.

Abstract

En stamcell definieras som en cell med förmåga att både själv förnya och generera flera differentierade avkomma. Embryonala stamceller (ESC) kommer från blastocysten av de tidiga embryot och är pluripotenta i differentiative förmåga. Deras enorma differentiative potential har gjort dem i fokus för mycket forskning inriktade på att kunna utläsa hur man lirka dem att generera kliniskt användbara celltyper. Den framgångsrika härledning av hematopoetiska stamceller (HSC) från mus ESK har nyligen gjorts och kan visualiseras i denna video protokoll. HSC, utan tvekan den mest kliniskt exploaterade cellpopulation, används för att behandla en myriad av hematopoetisk maligniteter och störningar. Men många patienter som kan dra nytta av HSC terapi saknar tillgång till lämpliga givare. ESK skulle kunna utgöra en alternativ källa av HSC för dessa patienter. Följande protokoll upprättas en baslinje från vilken ESC-HSC kan studeras och informera ansträngningar att isolera HSC från mänsklig ESC. I detta protokoll är ESC differentierade som embryoid organ (EBS) i 6 dagar i kommersiellt tillgängliga serum förhandsgranskas för optimal hematopoetisk differentiering. EB är sedan dissocierade och infekterade med retrovirus HoxB4. Infekterade EB-härledda celler är pläterade på OP9 glatta en benmärg stromaceller cellinje härstammar från calvaria av M-CSF-/ - möss, och co-odlade i närvaro av blodbildningen främja cytokiner i tio dagar. Under denna co-kultur, de infekterade cellerna expanderar kraftigt, vilket resulterar i generationen en heterogen grupp av 100s miljontals celler. Dessa celler kan sedan användas för att rädda och återupprätta dödligt bestrålade möss.

Protocol

Differentiering av embryonala stamceller

Samla ett nära konfluenta kolv av embryonala stamceller (ESC) via behandling med ESC trypsin.
Resuspendera cellerna i 5 ml Differentiering medier och överför till en icke-gelatin belagda T25. Inkubera vid 37 ° C i 45 minuter. Hämta supernatanten och samla in celler via centrifugering.

Anm: Musen embryonala fibroblaster (MEFs) från ESK kulturer fäster lätt på de icke-gelatin belagda T25 och därmed är utarmat från kulturen under denna plätering steg. Om du inte är odling dina ESC på MEFs kan du hoppa över pre-plattan.
Resuspendera MEF-utarmat ESC i Differentiering medier vid 333.333 cells/50 ml. Denna koncentration ger 100 ESC/15 ml.
Använda flerkanals pipett, tallrik ESC vid 100 cells/15 mL droppe på 15 cm ² Petri plattor. Med ett 8-kanals pipett, bör du kunna få in ca 18-22 rader av droppar per platta (ca 5 ml per platta).

Anm: För detta protokoll kommer 2-5 15 cm ² rätter av droppar vara mer än tillräckligt och bör ge 2-5 x 10 ⁶ dag sex EB-härledda celler.
Försiktigt vända plattor för att invertera droppar. Inkubera vid 37 ° C 5% CO ₂ i 48 timmar.
Pool droppar genom att försiktigt snurra tallrikar och transfer till 15 ml koniska rör. Skölj plattor med 4-6 mL PBS och lägga till samma 15 ml konisk.

Notera: Du kan pool upp till fem droppe plattor. EBS kommer att växa som de fortsätter att differentiera och om de är för koncentrerade de tenderar att bilda stora klumpar.
Låt poolade EB att lösa genom självtryck (ca 10 minuter). Aspirera supernatanten utan att störa EBS. Försiktigt resuspendera i 10 medier ml Differentiering och överföring till 10 cm icke-häftande Petri platta.
Placera petri plattan på tallriken skak vid 50 rpm och inkubera vid 37 ° C 5% CO _2.
24 timmar senare (dag fyra av differentiering), att snurra tallrikar koncentrera strandsandaler centrum petriskål. Noggrant utbyte 50% av media (5 ml) med 5 ml färsk Differentiering Media. Återgå plattan inkubator för ytterligare två dagar.

EB dissociation och infektion med MSCV-HoxB4-IRES-GFP

På dag sex av differentiering, överföring EBS 15 ml koniska rör. Låt sedimentera av tyngdkraften.
Aspirera medier och återsuspendera i 10 ml PBS. Låt EBS bosätta av tyngdkraften. Aspirera PBS.
Tillsätt 250 ml dissociation enzym mix och 1 mL PBS. Inkubera i 37 ° C vattenbad under 20 minuter, ibland virvlande tub att blanda enzymer och EBS.
Lägg till 8 ml enzym-fria dissociation buffert.
Mal sönder blandning med 5 ml pipett tills EB är helt dissocierade (ca 10 gånger, överdriven pipettering kommer att öka dödsfall inom EB-härledda cellberedningen).
1. Blandning blir grumlig med celler som EB dissociera.
2. Placera pipettspetsen mot botten av koniska röret under trituration kommer att skapa en skjuvkraft som kommer att väsentligt underlätta dissociation.
Samla cellerna via centrifugering.
Resuspendera EB-härledda celler i 5 ml 10% IMDM och räkna med trypan blå utanförskap

Notera: Mellan dag fyra och dag sex av differentiering, EBS kaviterade vilket resulterar i en stor mängd av apoptos och death.Thus cell, på dagen sex, uppåt 30% av EB-härledda celler kan fläcken med trypan blå.
Resuspendera EB-härledda celler vid 100.000 celler / 2 ml 10% IMDM + virus supernatanten så att en MOI på 5-10 är achieved.Add protaminsulfat till en slutlig koncentration av 8 mg / ml.

OBS: Förbered nog EB / virus supernatanten mix till tallrik fyra 6-brunnars plattor (förutsatt 2 ml / brunn).
Plate 2 ml EB / viralt supernatanten mix per brunn av fyra 6 brunnar före pläterade med OP9 stroma celler (se nedan).
Centrifugera plattorna vid 2500 rpm i rumstemperatur i 90 minuter. Överföring plattorna inkubator vid 37 ° C 5% CO _2.
4-6 timmar senare skörd supernatanten från tallrikar och samla in eventuella celler kvar i suspension genom centrifugering.
Resuspendera pellet (kan vara små) i 48 ml 10% IMDM + cytokiner. Fördela 2 ml / brunn av resuspension till ursprungliga fyra 6-brunnars plattor där infektion utfördes och supernatanten samlades in.

Obs: Alltid förbereda 10% IMDM + cytokiner färska vid användningstillfället.
Inkubera plattorna vid 37 ° C 5% CO ₂ i sju dagar. Kolonier bör vara uppenbart för dag fyra efter infektion och stora och välformade per dag sju. En robust expansion bör ge 40-60 kolonier / brunn på dag sju.
På dag sju post-infektion, samla in och pool alla celler (inklusive OP9 stroma) från alla brunnar genom behandling med trypsin.

OBS: INTE kassera supernatanten eller PBS tvättar anställd under trypsin treatment.At denna punkt i kulturen kan vissa kolonier bara löst vidhäftande och det finns många celler floating i suspension.Collect och poolen alla tvättar och supernatanten att säkerställa att inga potentiellt värdefulla celler kasseras.
Resuspendera cellerna i 8 ml färsk 10% IMDM + cytokiner. Fördela 2 mls / kolv i fyra T75 kolvar. Lägg till ytterligare 13 mls 10% cytokiner IMDM + till varje kolv. Inkubera vid 37 ° C 5% CO ₂ i tre dagar (totalt tio dagar efter infektion).

Kultur och plätering av OP9 stroma

Behåll OP9 glatta enligt standardprotokoll i 20% a-MEM. OP9 celler kommer att ändra egenskaper när vuxit till confluency. Alltid dela på 80% confluency på högst 1:03 split.
24 timmar före infektion i dag sex EB-härledda celler med MSCV-HoxB4-IRES-GFP, plåt 25.000 OP9 celler / brunn av fyra 6-brunnars plattor i 20% a-MEM.

Insamling, fraktionering och transplantation

Samla celler expanderat på OP9 stroma i tio dagar genom behandling med trypsin. Räkna celler.

OBS: INTE kassera supernatanten eller PBS tvättar anställd under trypsin behandling. Vid denna punkt i kulturen kan vissa kolonier bara löst vidhäftande och det finns många celler flytande i suspension.Collect och poolen alla tvättar och supernatanten att säkerställa att inga potentiellt värdefulla celler kasseras.

OBS: En bra expansion bör ge mellan 40-50 x 10 ⁶ celler / original 6-brunnar infekterade, för totalt 160-200 x 10 ⁶ celler.
Celler kan fraktioneras via magnetisk pärla val eller FACS enligt standardmetoder vid denna punkt i protokollet.
För transplantation, levererar cellerna via retro-orbital eller svansvenen injektion till Rag-2/gc bristfällig mottagare (som väger mellan 15-22 gram) utsätts för en delad dos av 9,25 Gy av bestrålning 2,5 timmar. isär.

OBS: Det är viktigt att djurens vikt ligger mellan 15-22 gram vid tiden för bestrålning. Om de är större än 22 g kommer 9,25 Gy är inte en tillräcklig dos av strålning för att säkerställa lämplig ablation och cellerna får inte medla räddning från dödliga strålning och / eller ympas på hematopoetisk facket. Om transplantation större djur, måste lämpliga strålningsdos bestämmas experimentellt.
En minsta dos på 2-5 x 10 ⁶ celler / djur är skyldig att garantera rädda från dödliga strålning. Om fraktionering celler, injicera 2-5 x 10 ⁶ celler medel (t ex om befolkningen i ränta motsvarar 10% av ofraktionerat pool av celler, injicera 2-5 x 10 ⁵ celler / djur).

Obs: Om injicera> 2 x 10 ⁶ celler, Injicera alltid via svansvenen att undvika teratom bildas i omloppsbana, vilket kan medföra när ett stort antal celler levereras retro-orbitally.
Behåll Rag-2 ^{- / -} / GC ^{- / -} brist mottagare i autoklaveras burar. Beroende på "renhet" av djuret anläggningen, får efter transplantationen djur kräver tillförsel av försurade vatten eller Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) för 5 veckor efter dödlig strålning.
Räkna med> 90% GFP + ES-derived leukocyter i perifert blod efter 3 veckor efter transplantation. Engraftment bör flera härstamning, även lymfocyter är kända för att tysta retrovirus HoxB4-IRES-GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc