Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

كتكوت البيضة السابقين الثقافة و البيضة السابقين CAM الفحص : كيف يعمل حقا

doi: 10.3791/1620 Published: November 30, 2009

Summary

وفرخ مشيمائي غشاء (CAM) هي فريدة من نوعها ، العوز المناعي طبيعيا بيئة ثقافة داعمة لدراسة الأوعية الدموية وتكون الأورام. هذه المقالة الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في الفرخ

Abstract

بيض الدجاج في مرحلة مبكرة ما بين تربية في المختبر والمجراة في النظم وتوفير بيئة اختبار الأوعية الدموية ، ليس فقط لدراسة الأوعية الدموية ولكن أيضا لدراسة تكون الأورام. بعد غشاء مشيمائي الفرخ (CAM) وقد وضعت ، ويمكن شبكتها الاوعية الدموية يمكن الوصول إليها بسهولة ، والتلاعب بها ومراعاتها ، وبالتالي يوفر بيئة مثالية لفحوصات الأوعية الدموية. لأن النظام لا اللمفاوية تطويره بالكامل حتى مراحل متأخرة من الحضانة ، الجنين الفرخ بمثابة المضيف العوز المناعي بشكل طبيعي قادر على الحفاظ على الأنسجة والخلايا المطعمة أنواع محددة من دون قيود. بالإضافة إلى رعاية وتطوير ألو xenografts ، والأوعية الدموية CAM الشبكة يوفر بيئة داعمة لفريد intravasation الخلية السرطانية ، والنشر ، واعتقال الأوعية الدموية والخلايا مستودع حيث اعتقل يتسرب إلى النموذج الصغير المتنقل البؤر.

لأغراض تجريبية ، في معظم الدراسات التي تعرضت لها مؤخرا بقطع CAM نافذة من خلال قشرة البيضة وأجريت التجارب في البيضة ، مما أدى إلى فرض قيود كبيرة في الوصول للCAM وإمكانيات المراقبة وثائق صورة من الآثار. كانت معدلات البقاء على قيد الحياة من هذه الثقافات وعندما استخدمت قذيفة أقل ثقافات الجنين الفرخ 1-4 ، تقدم أية تفاصيل التجريبية ، وإذا نشرت على الإطلاق ، منخفضة. نحن المكرر طريقة البيضة الثقافة السابقين لافراخ الدجاج بشكل ملحوظ من خلال طرح عقلاني من قذف للرقابة على محتوى البيضة. هذه الثقافات السابقين البيضة تعزيز إمكانية الوصول إلى الجنين CAM وفرخ ، مما سهل في الوثائق المجراة من الآثار وتسهيل التلاعب التجريبية للجنين. يسمح هذا التطبيق الناجح لعدد كبير من المسائل العلمية : (1) باعتبارها مقايسة تحسين الأوعية الدموية 5،6 ، (2) والتجريبية التي أنشئت من أجل تسهيل الحقن في الجسم الزجاجي للعين الفرخ الجنين 7-9 ، (3) كما فرقت بيئة اختبار للنشر وintravasation الخلايا السرطانية من خطوط الخلايا أنشئت على تلقيح CAM 10-12 ، (4) وتحسين نظام دعم لعملية زرع ناجحة وثقافة براعم الأطراف من الدجاج والفئران وكذلك 13 (5 ) للترقيع ، ونشر ، وإعادة ترقيع الصلبة نسيج الورم الرئيسي الحصول عليها من الخزعات على سطح CAM 14.

في هذه المقالة الفيديو وصفنا في إرساء ثقافة الفرخ السابقين المكرر البيضة وCAM مقايسة مع معدلات البقاء على قيد الحياة أكثر من 50 ٪. إلى جانب نقدم خطوة خطوة من خلال مظاهرة للتطبيق الناجح للثقافة البيضة السابقين لعدد كبير من التطبيقات العلمية.


ساهم دانيال س بحسب دوليه ، سوزان دال باشا ، وسيباستيان Gustmann بالتساوي على هذه الدراسة.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

جميع المعدات والكواشف يتعين شراؤها معقمة أو يحتاج إلى الحرارة أو البخار أو تعقيمها تعقيم مع ETOH 70 ٪.

الدولة من الكتاب والتي أجريت على حيوانات التجارب وفقا للمجتمعات الأوروبية توجيه المجلس (86/609/EEC) ، في أعقاب المبادئ التوجيهية لمعاهد الصحة القومية بشأن رعاية واستخدام الحيوانات لإجراءات تجريبية والانظمة التي وضعتها المؤسسات الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة (IACUC) في جامعة دويسبورغ إيسن (ألمانيا).

الجزء 1 : حاضنات البيض

  1. ويمكن تخزين البويضات المخصبة في 13 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  2. يتم تحضين البيض لمدة 72 ساعة ، والكذب أفقيا في حاضنة مع علبة نقل ، وتناوب على البيض 12 مرات في اليوم بشكل مستمر. الرطوبة يتم الاحتفاظ بنسبة 60 -- 62 بالمائة ، ودرجة الحرارة في الحضانة 37.5 درجة مئوية.
    ملاحظة : قبل البدء في الحضانة ، والأوساخ ، والريش والغائط وإزالة بعناية من قشر البيض ميكانيكيا بواسطة المسح مع الجافة ، والرمادي ورقة مشتركة مناشف اليد متعرجة ، والتي لها الخام بدلا من بنية سطح ناعم. مسح البيض مع الايثانول أو مطهر ، ومع ذلك ، خفضت بشكل ملحوظ معدل البقاء على قيد الحياة من الأجنة ، بصرف النظر عن السوائل المستخدمة.

الجزء 2 : البيضة الثقافة السابق

  1. بعد حضانة لمدة 72 ساعة ، يتم إزالة البيض من الحاضنة.
    ملاحظة : يتم تحضين البيض لمدة 72 ساعة لأنه -- وفقا لتجاربنا -- لأسباب غير معروفة ولكن في اتفاق مع وآخرون أورباخ al.1 مراحل التطور في وقت سابق ان معدلات البقاء على قيد الحياة أقل من ذلك بكثير. في مراحل لمدة 72 ساعة في وقت لاحق من الكيس المحي التي لم تتم تغطيتها بعد من قبل CAM يصبح أرق ويميل إلى الانضمام إلى قشرة البيضة الرائدة (ط) لنزف صغير في منطقة الانضمام و (ب) تمزق الكيس ، صفار الغشاء. في ذلك طريقة عرض لا ينطبق على الأجنة أقدم من 72 ساعة.
  2. يتم وضع علامة على الجانب العلوي من البيض ، حيث يتواجد الجنين ، من خلال قلم منذ الجنين يقاوم التناوب إلى حد معين.
  3. يعقد البيض أفقيا مع العلامة قلم رصاص على رأس ومتصدع على حافة 80 ملم الثلاثي شريط مغناطيسي وضع عمودي التوجه إلى المحور الطويل للبويضة.
    ملاحظة : للحصول على شعور أفضل ، وينبغي عدم استخدام قفازات ، ولكن يجب تطهير الأيدي مع EtOH 70 ٪. من المهم أن يتم فتح قشرة البيضة ، وكذلك غشاء البويضة تصل. تسريب البيض هو علامة آمن بأن غشاء البويضة وقد مثقبة.
  4. يتم الاحتفاظ البيض على مقربة من الجزء السفلي من طبق بيتري لتجنب تسرب مزيد من البيض.
    ملاحظة : أثناء الإجراء فتح الأولية ، فمن المهم أن لا يزال متصلا والبيض على الجزء السفلي من صحن بيتري لبقية داخل البيض لأن هذا يؤدي إلى فراغ داخل البويضة التي تتولى صفار مع الجنين على رأس داخل البويضة. يمكن تنظيم الفراغ إما عن طريق ضغط الإصبع التي تسيطر على مدخل الهواء إلى البيض أو من خلال رفع البيض الذي يزيد من توصيل أي عمود من البيض الفراغ.
  5. بلطف من خلال تطبيق الضغط على الزوال من خلال تشغيل الكراك وخط الاستواء للبويضة بواسطة الإبهام والأصابع الوسطى فمن الممكن لتنظيم هذا الفراغ. ويمكن بعد ذلك محتوى البيضة يتم تحويلها الى طبق بيتري التالفة ، إذا تم رفع بلطف مع صفار بيضة ويتم فصلها بعناية كل شطر من قذيفة. يجب على الجنين والأوعية صفار تقع على أعلى من صفار التالفة.
    ملاحظة : إذا لم يتم الاحتفاظ علامة على رأس قلم ، قد تؤذي الجنين عند تشقق القشرة. إذا كنت لا تصدع البيض بعناية كافية أو الأجنة تكون أقدم من 72 ساعة (انظر أعلاه) ، وكيس صفار العصي على قذيفة والتمزقات في أغلب الأحيان. الشيء نفسه يحدث عندما تكون الرطوبة من الحاضنة أقل من 60 ٪ أو البيض لا استدارة أثناء الحضانة.
  6. يتم إرجاع الثقافات البيضة السابقين إلى حاضنة والاحتفاظ بها في 37.5 ° 38.2 درجة مئوية والرطوبة 60 ٪. CO 2 أو O 2 امدادات غير ضرورية إذا لم يتم إغلاق الحاضنة بإحكام (شبكة التهوية مفتوحة جزئيا!) وتستخدم خاصة مع أطباق بتري الفواصل بين الغطاء والطبق.
    ملاحظة : نقل الأجنة يجب أن تبقى إلى أدنى حد ممكن خلال الأيام الأولى من الحضانة. نتائج الكثير من الإثارة في معدلات وفيات مرتفعة. ابتداء من الحضانة 9 ايام ، والأجنة هي أقل حساسية للالانفعالات.
    يجب إزالة الأجنة الميتة على الفور لتجنب العدوى.
    إذا تم استخدام حاضنات ثقافة الخلية ، والتي هي مغلقة بإحكام ، O 2 العرض إلزامي للأجنة لا يموت. الرطوبة أمر ضروري لCAM لا تجف ، وإذا كانت درجة حرارة الحضانة هي أقل من 37 درجة مئوية ، والأجنة وسوف تتطور ببطء أيضا.

الجزء 3 : تطبيق المواد لفحوصات الأوعية الدموية

  1. تعقيمها أوراق الترشيح مطوية (5واللكم 0.5 مليمتر في القطر) من قبل الناخس حفرة وتستخدم المواد الداعمة (الناقل) بالنسبة للمواد السائلة تطبيقها على CAM.
    تقريبا كل مادة تسبب الناقل (انظر الجدول أدناه) تهيج CAM ، وخصوصا عندما تطبق قبل يوم 10 حضانة ، كما انها غيرت السفينة CAM النامية العمارة : مذكرة. كما تضمنت هذه المواد الخاملة يحتمل مثل السليلوز احباط هيدروكسي إيثيل والإسفنج التفلون (PTFE - pledgets) ، والإسفنج الكولاجين ، واحباط الكولاجين ، شاش معقم (مسحات) ، ينزلق تغطية المستديرة ، وحلقات السيليكون ، والتي تسببت في كل نتائج إيجابية كاذبة. ويبدو مرشح ورقة للتسبب في تهيج الأقل ، وكان يستخدم في ذلك فحوصات لدينا.
  2. عندما يتم تطويرها بالكامل CAM ، قد يتم تطبيق ما يصل الى 6 عينات مختلفة ، ويمكن مقارنة آثارها على كام واحد.
  3. وينبغي لتجنب تجفيف المرشحات جرعات إضافية (3 ميكروغرام angiotropin الأم) أو العازلة (5 PBS ميكرولتر) يعاد تطبيقها في كل يوم.
  4. من يوم 3 بعد التطبيق ، والأوعية الدموية توجيه المواد نحو عائية على المرشحات ، في حين أن نمط الأوعية الدموية المحيطة الضوابط هو دون تغيير.
    ملاحظة : يجب أن لا يكون مخطئا CAM للكيس ، صفار البيض. وكام هو بنية ديناميكية النامية بينما كيس الصفار ثابت مع وجود فروق ضئيلة خلال التنمية. يمكن على تطوير ثلاثة ايام يتم الاعتراف CAM النامية لأول مرة في نهاية الذيلية للجنين باعتباره حويصلة صغيرة. بين ثلاثة أيام وعشرة أيام في الحويصلة الأولية توسع ، وخلق طبقات مطوية اثنين غشاء overgrowing الكيس المحي بمعدل متزايد. يجب أن يكون التطبيق موقع في منتصف الطريق بين جنين وحظيرة CAM (الحدود) وإلا الجنين يعيق مراقبة مجهرية من آثار في ضوء المنقولة. بدلا من ذلك ، هو المرشح المنضوية مع جوهر عائية عندما CAM ازدياد مستمر.

الجزء 4 : التلقيح من الخلايا على وCAM

4.1.Preparation من الخلايا

  1. يتم نقل خلايا متكدسة من قارورة الثقافة لأنابيب فالكون من استخدام معقم 25 مل ماصة بلاستيكية باستخدام المساعدات ماصة.
  2. لتقدير عدد الخلايا ، يتم نقل 15 ميكرولتر من تعليق خلية إلى غرفة نويباور ويتم عد الخلايا يدويا تحت المجهر.
  3. وطرد أنابيب الصقر لمدة 3 دقائق في 1000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة ويتم تجاهل طاف.
  4. لتعقب الخلايا الحية ، وتضعف الخلايا مع برنامج تلفزيوني للتركيز المطلوب (هنا : 2x10 7 خلايا / مل) ، وعلى سبيل المثال ملطخة PKH26 (سيغما) ، أحمر فلوري غشاء الخلية الحية مجموعة العلامات ، وفقا لبروتوكول الصانعين.
    هي خلايا إعادة معلقة في مستنبت خلايا (تفضيلي المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر ؛ DMEM) إلى التركيز المطلوب للحقن (10 7 خلية / مل) أو التلقيح (3x10 6 خلية / مل). يتم تطبيق تركيزات مختلفة من الخلايا لحقن التطعيم ضد وفقا لتركيزات التي سبق نشرها في الأدبيات 15-17 وتجربتنا.

4.2 تلقيح خلايا على كام

  1. تقطع حلقات (~ 1MM سمك) من طرف ماصة 1ml أو القسطرة الوريدية الطرفية (PVL) أنبوب عن طريق استخدام مشرط حاد وتطبيقها على CAM من جنين الفرخ E6 - E14 البيضة السابقين مثقف.
    ملاحظة : حاول أن لا "يرى" عدة مرات ولكن لقطع طريق التلميح أو أنبوب القسطرة ماصة مع واحد قطع باستخدام مشرط جديد وحاد للغاية لتجنب حواف حادة على الحلقات الناتجة عن ذلك. التحقق من حلقات تحت المجهر عن الحواف الحادة الناتجة عن الشقوق الصغيرة.
  2. اعتمادا على حجم الحلقات هي pipetted 20 ميكرولتر من 3x10 الخلايا خلية / مل 6 في المجموع في حلقة واحدة أو وحدات تخزين انقسم الى حلقات متعددة.
    ملاحظة : في بعض الحالات من traumatisation CAM عن طريق كشط لطيف هو شرطا مسبقا ، على سبيل المثال لتسهيل تلقيح خلايا 17 و capillarisation من الطعوم (أنظر أدناه). إذا ، ومع ذلك ، وليس المقصود من traumatisation CAM أو contraindicative ، على سبيل المثال لإجراء دراسات حول إمكانية الغازية من الخلايا السرطانية ، لا ينبغي أن تستخدم لحلقات التلقيح ، ولكن ينبغي أن تطبق بشكل مباشر على خلايا تطبيق الخواتم أو حلقات أنفسهم قد حث الآفة الصغرى . إذا تم استخدام الحلقات ، يجب أن تقطع هذه كما رقيقة ممكن لتقليل الوزن وتجنب المسافة البادئة للCAM.

الجزء 5 : حقن الخلايا Intravitreous

  1. يتم شطف ألف حقنة ميكروليتر هاميلتون عدة مرات مع EtOH 70 ٪ ، وأخيرا مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
  2. يتم تعبئة حقنة صغيرة مع تعليق أعدت خلية الملون أو غير ملوثين (انظر الجزء 4.1).
    ملاحظة : موقع الحقن والتي سيتم اختيارها بعناية ، وليس لإصابة الأوعية الدموية للهياكل CAM أو المتاخمة للجنين (brain!) مع أكثر من اختراق الإبرة. وينبغي أن يتم حقن تحت مجهر تشريح.
  3. تحت السيطرة المجهر، بعناية ، ولكن سرعان ما تخترق CAM وطبقات العين مع إبرة حقن حقنة ومستمر من 10 إلى 20 القصوى تعليق خلية ميكرولتر (مخفف تفضيلي في برنامج تلفزيوني) في الجسم الزجاجي في جنين البيضة فرخ بحكم تربيتها.
    ملاحظة : إذا لا يمكن أن يخترق كام مع الإبرة ، يمكن إزالته في موقع مع الأوعية الدموية قليلة أو معدومة من قبل تمزق إربا برفق مع اثنين من الملقط.
  4. وينبغي أن تبقى الإبرة 1-2 ثانية في العين لتجنب فقدان تعليق حقن الخلايا عن طريق التسرب.

الجزء 6 : تشريح للبراعم الأطراف الدجاج

  1. تتم إزالة البيض من الحاضنة بعد 3 إلى 4 أيام من الحضانة (= E3/E4 هاميلتون هامبورغر (سمو) stage18 - 23)
  2. هي تشقق البيض على حافة شريط مغناطيسي الثلاثي ، ونقلها إلى طبق بيتري (التفاصيل : انظر الجزء 2) ويتم تشريح الجنين من السفن صفار متصلة بواسطة القطع باستخدام مقص حلقة الربيع.
  3. يتم نقل الجنين الى طبق بيتري جديدة مليئة PBS ، الباردة العقيمة باستخدام ملعقة صغيرة استنزاف وغسلها من قبل التحريض النوع.
  4. يتم نقل الجنين الى طبق بيتري صغيرة مليئة PBS العقيمة والتي تحررت من الأغشية المحيطة بها ، وتمزيق بعناية مع ملقط بينهما بخير.
  5. يتم فصل براعم الأطراف بواسطة ملقط المجهرية أقرب إلى الجسم ممكن ، اغتنامها وتحويلها إلى CAM من الدجاج المضيف 8-10 يوما من العمر البيضة مثقف السابقين (انظر التطعيم الداخلي).

الجزء 7 : إعداد براعم الأطراف الماوس

  1. يتم تعيين وقت التزاوج والحمل حتى تم تعيينه في صباح اليوم الذي تم الكشف عن المكونات المهبلي في الحمل 0 التزاوج الإناث اليوم.
  2. والتضحية من قبل الإناث الحوامل خلع عنق الرحم عند وضع الأجنة وصلت اليوم الجنينية (E) 10 إلى 13 والثابتة على متن الشمع.
  3. هو مبلل جدار البطن مع ETOH 70 ٪ ، وقطع على طول خط الوسط ويتم إصلاح اللوحات أفقيا الجلد بواسطة المسامير.
  4. تتم إزالة كل من قرون الرحم من البطن ، وفصل ونقل إلى دورق مع PBS الباردة.
  5. يتم فصل الأجنة ، ونقل إلى طبق بتري وجدار الرحم والأغشية الجنينية يتم إزالتها بعناية باستخدام ملقط.
  6. يتم قطع براعم الأطراف قبالة عن طريق استخدام مقص فصل الربيع أو بواسطة ملقط غرامة أقرب إلى الجسم ممكن ، اغتنامها وتحويلها إلى CAM من 8-10 ايام من العمر الدجاج المضيف البيضة مثقف السابقين (انظر التطعيم الداخلي).

الجزء 8 : جمع عينات من الورم

  1. يتم جمع عينات للفحص الورم في 2 مل أنابيب إيبندورف مليئة ورم المتوسطة خلية ثقافة محددة (هنا : متوسط ​​يبوفيتش) والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة.
  2. يتم قطع الورم في الخزعات 1-2 MM3 القطع التي المشارط معقمة.
    ملاحظة : إذا كانت عينات الاورام الصغيرة جدا ، وأنها قد لا نعلق على كأم ، وإذا كانت كبيرة جدا ، قد تكون إصابة الجنين CAM وربما يموت.
  3. غير المطعمة قطعة من جوهر على عينة خزعة من CAM من 8-10 ايام من العمر الدجاج المضيف البيضة مثقف السابقين (انظر التطعيم الداخلي).
    ملاحظة : أخذ مواد من سطح خزعة يزيد من مخاطر التلوث مع العضلات أو النسيج الضام.

الجزء (9) : التطعيم الداخلي

  1. لتطعيم براعم الأطراف أو عينات الورم ، CAM تطويره بالكامل من 8-10 ايام من العمر افراخ الدجاج المستخدمة هي البيضة بحكم تربيتها.
  2. يتم وضع مثالي للترقيع على CAM بالقرب من التشعب Y في أحد الاوعية الدموية.
  3. في موقع التطبيق المطلوب ، هو الصدمة التي انتقائي CAM كشط قبالة لطيف (ملقط) الجزء العلوي من حوائط الأدمة الطبقة الظهارية مزدوجة ، وترك الطبقة القاعدية سليمة.
    ملاحظة : من الضروري تجنب النزيف أو تمزق مرئية من الشعيرات الدموية.
  4. ونقلت والكسب غير المشروع إلى الحد الأدنى من برنامج تلفزيوني مع CAM المرفقة. اعتمادا على الكسب غير المشروع ، قد يكون وضعه مرة أو مرتين في موقع CAM ، حيث يقصد أي تطعيم النهائي لإزالة PBS المفرطة والمطعمة ثم أخيرا في موقع CAM مستعدة للصدمة.
  5. واستوعب الكسب غير المشروع من قبل الطبقات الراقية وملقط على كام. تبعا لحساسية والكسب غير المشروع ، يمكن أن تطبق ضغط خفيف (لا تصلح للبراعم الأطراف) على المناورة والكسب غير المشروع مما أدى إلى المسافة البادئة للCAM (مناسبة لعينات الورم).
    ملاحظة : ونظرا لأن نظام المناعة الفرخ تطور الجنين في اليوم (E) 18 ، لا ينبغي أن البيضة السابقين xenografts الثقافات يكون لفترات طويلة خارج E17 كما افراخ الدجاج يموت المضيف بشكل متكرر.
    فمن المهم أن يكون المضيف الحدب المتاحة ، على التوالي افراخ الدجاج البيضة السابقين مثقف ، ليتزامن مع مصدر من الأنسجة المانحة التي تختارها.

الجزء 10 : إعادة ترقيع

  1. وقتل الجنين الفرخ المضيف قطع الرأس.
  2. ومع CAMتتم إزالة الفساد التي توليها قطع دائرية مع مقص وأشار ونقل إلى طبق بيتري مليئة برنامج تلفزيوني.
  3. يتم قطع CAM المفرط من الكسب غير المشروع من قبل مقص الربيع باستثناء موقع مرفق السابقة.
  4. في حالة الورم أكبر من العينات ، والكسب غير المشروع في خفض نصفين أو عدة أجزاء أصغر وإعادة المطعمة مع المتطورة التي تواجه CAM الجديد للمضيف الثاني.

الجزء 11 : النتائج الممثل

الشكل 1
الشكل 1. قذيفة أقل الدجاج الثقافة
أجنة الدجاج من البيضة مراحل التنمية المختلفة السابقين مثقف في أطباق بتري.

الشكل 2
الشكل 2. تحويلة الأوعية الدموية CAM البيضة مقايسة
وحضنت بيض الدجاج المخصب أفقيا عند 37 درجة مئوية والرطوبة 60 -- 62 ٪ ، وتصدع في أطباق بتري في اليوم الجنينية 4 (E4). واستمر الاحتضان وفقا للشروط نفسها. في أوراق E10 تصفية العقيمة (5.5 مليمتر في القطر) والطبقات على رأس CAM وإما غارقة في برنامج تلفزيوني مع 5 ميكرولتر أو 3 ميكروغرام angiotropin6 الأصلي. وأظهرت الشعيرات الدموية المحاذاة واضحة تجاه الورقة angiotropin تصفية غارقة في E14.

الشكل 3
الشكل 3. البيضة تحويلة تطعيم براعم الأطراف
والمطعمة براعم الأطراف من الفرخ (E3/E4) والفأرة (E13) على CAM الثقافات الدجاج قذيفة أقل. دخلت الأوعية الدموية من كام براعم أطرافهم بعد يومين. واصلت تطوير براعم الأطراف في هذه الثقافات السابقين البيضة صلت إلى مرحلة الكتائب اثنين في الفرخ والحد من عرض صفحات ويب بين الأصابع براعم الأطراف في الفئران.

الشكل 4
الشكل 4. تلقيح البيضة سابق من عينة الورم
وقد طعمت عينة خزعة من سرطان المثانة على كام من جنين الفرخ 10 يوما من العمر البيضة بحكم تربيتها. بعد يومين في الثقافة ، وكان متصلا عينة الورم إلى الأوعية الدموية CAM وبعد 7 أيام ، وقد لوحظت عدة الأوعية الدموية التي تدخل الكسب غير المشروع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مبتكرة أو مجرد ثقافة الفرخ بروتوكول آخر؟

مع بروتوكولات الثقافة السابق قذيفة كانت أقل من معدلات البقاء على قيد الحياة 1-4 الإجمالية للأجنة الدجاج منخفضة ، مثل كاليفورنيا. 30 ٪ 1. والمكرر بروتوكول السابقين الثقافة البيضة وصفها في هذه المقالة الفيديو ، على النقيض من ذلك ، يسمح لمعدلات البقاء على قيد الحياة أكثر من 50 ٪. بالمقارنة مع الثقافات الكلاسيكية في الثقافة البيضة البيضة السابقين لافراخ الدجاج يسهل كثيرا من إمكانية الوصول إلى الجنين CAM والفرخ ويمكن التلاعب بهم التجريبية والرصد المستمر. ويمكن استخدام هذا الأسلوب الثقافة لمجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات التي تتراوح بين 5،6 تعزيز المقايسات الأوعية الدموية ، لتسهيل الحقن في الجسم الزجاجي للعين الفرخ الجنين 7-9 ، المقايسات intravasation 10-12 ، وتحسين عمليات ترقيع ونمو براعم الأطراف 13 وصيانة مبتكرة لعينات الورم 14. وهكذا ، والثقافة البيضة السابقين يسهم أداة مفيدة في مجال البحوث التنموية وangionesis والورم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر J. J. Kueper وWittschier للحصول على مساعدة فنية ممتازة وRuebben البروفيسور لتوريد المواد بسخاء الورم.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fertilized Eggs Animal Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice Animal Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray Tools Siemens AG 9503 Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160 Tools Grumbach, Germany 8101 Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS Reagent Sigma-Aldrich PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium Reagent Sigma-Aldrich D 6429 DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium Reagent Invitrogen 31415-029 here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium Reagent Sigma-Aldrich each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium
supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH Reagent Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm Tool VWR international 442-0391 A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5 Tool Fine Science Tools 11252-30 bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7 Tool Fine Science Tools 11271-30 curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm Tool Fine Science Tools 15000-00 fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight Tool Fine Science Tools 14094-11 Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt Tool Fine Science Tools 14007-14 Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl Tool Hamilton Co 80222 Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm) Tool Fine Science Tools 18073-15 Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels Tool Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon Tool Geuder 15758 Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins Tool Home made Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm Tool Greiner Bio-One 628102
Petri dishes 92 x 16 mm Tool Sarstedt Ltd 82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm Tool Greiner Bio-One 664160 extra deep, with spacers for ventilation
Beaker Tool 300-600 ml
FALCON tubes Tool Falcon BD 15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes Tool Eppendorf 1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips Tool Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL) Tool Viggo® Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips Tool Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter Tool Schleicher Schuell 311643 Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm Tool santec-medical REF 277, LOT 832/511-1 Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 Reagent Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF Reagent BASF S30200 mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura Tool Baxter Internationl Inc. REF B2246000999999 Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm Tool Assistent Germany 1001/0011 Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge Tool Wyeth Animal Health Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane Tool Resorba Woundcare Germany LOT 280303 Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs Tool Fink Walter GmbH REF 328132 Carrier; caused false positive results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
  2. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology. Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).
  3. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).
  4. Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).
  5. Höckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and "tube formation" but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro. J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).
  6. Wissler, J. H. Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins]. Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).
  7. Kistler, H. B. J. r., LaVail, J. H. Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).
  8. Halfter, W. Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).
  9. Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo. Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).
  10. Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia. Urol. Res. 20, 237-239 (1992).
  11. Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane. Pathol. Oncol. Res. (2008).
  12. Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model. J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).
  13. Hall, B. K. Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick. TCA Manual. 4, (3), 881-883 (1978).
  14. Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts' circulation. Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).
  15. McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma. Cancer Research. 37, 1003-1010 (1977).
  16. Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Research. 65, 10959-10969 (2005).
  17. Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
كتكوت<em> البيضة السابقين</em> الثقافة و<em> البيضة السابقين</em> CAM الفحص : كيف يعمل حقا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).More

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter