In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina

Summary

In questo articolo video dimostra la creazione di organotipica culture retina wholemount cytospin e una procedura per l'analisi di esogenamente effetti indotti. Organotipica culture retina wholemount imitare il

Abstract

Ablazioni mirata di geni e l'analisi di modelli animali è la strategia classica per la funzione dell'iscrizione gene specifico della retina. Tuttavia, transgenici, retina specifici o condizionale modelli di topo knockout spesso mostrano mortalità precoce o soffre di malformazioni gravi, impedendo l'analisi al di là fasi embrionali o postnatale precoce.

Colture di cellule primarie è un'alternativa per studiare gli effetti di fattori applicata ricombinante esogena, l'iperespressione di geni o di siRNA-mediato knockdown gene in un ambiente controllato. Colture di cellule dissociate ha il vantaggio che i segnali endogeni raggiungere le cellule bersaglio sono ridotte, facilitando l'identificazione di effetti esogenamente attivato dopo manipolazione farmacologica. Tuttavia, importanti interazioni cellula-cellula sono inizialmente distrutte per digestione enzimatica o dissociazione meccanica, anche se le culture retinospheroid riaggregati ¹ sono utilizzati.

Al contrario, organotipica culture retina wholemount fornire un sistema vicino al fisiologico in situazione vivo con le interazioni e le connessioni neuronali ^2-5 ancora conservati.

In questo articolo abbiamo video di fornire una dimostrazione passo passo (1) l'istituzione di in vivo, come organotipica culture wholemount della retina, comprese particolarità dissezione degli occhi murini embrionale, postnatale e adulta e (2) una procedura di dissociazione e cytospin per l'analisi dei neuroni apoptosi e la proliferazione delle cellule della retina in wholemounts organotipica, ad esempio dopo coltura in presenza di fattori esogeni applicata ricombinante.

Protocol

Tutte le attrezzature ei reagenti devono essere acquistati sterile o ha bisogno di essere calore o vapore, sterilizzati o sterilizzati con il 70% ETOH.

Gli autori affermano che gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Comunità europee direttiva del Consiglio (86/609/CEE), seguendo le linee guida del NIH per quanto riguarda la cura e l'uso di animali nelle procedure sperimentali e le norme stabilite dalla Animal Istituzionale Cura e uso Comitato (IACUC) presso l'Università di Duisburg-Essen (Germania).

Parte 1: enucleazione degli occhi murino di differenti stadi di sviluppo

Enucleazione degli occhi embrionale

1. Accoppiamenti tempo in stato di gravidanza sono istituiti e la mattina del giorno in cui viene rilevato un plug vaginale in accoppiamento le femmine è designato 0 gestazione giorno.
2. La femmina gravida, è stato immolato per dislocazione cervicale quando lo sviluppo degli embrioni ha raggiunto il livello desiderato (qui: giorno embrionale (E) 15) e fissato su un bordo di cera ^6.
3. La parete addominale è inumidito con il 70% ETOH, tagliare lungo la linea mediana e la lembi cutanei vengono fissati lateralmente da pin ^6.
4. Il uterusses vengono rimossi con l'addome, distaccato e trasferito in un bicchiere con PBS freddo ^6.
5. Gli embrioni sono separati, trasferito in una piastra di Petri e la parete dell'utero e delle membrane embrionali vengono rimossi con attenzione con l'uso di forcipe ^6.
6. Gli embrioni vengono uccisi per decapitazione.
7. Gli occhi sono enucleato essere l'uso di multa, pinze curve, "peeling" gli occhi dalle orbite.

Enucleazione degli occhi postnatale e adulta

1. Cuccioli sono uccisi per decapitazione, cuccioli e adulti più anziani con dislocazione cervicale.
2. Fino alla fase post-natale P15, il punto di tempo in cui i topi aprire gli occhi, fessure degli occhi devono essere aperti meccanicamente con l'uso di forcipe e ampliato da due tagli trasversali delle palpebre con le forbici a molla.
3. Gli occhi sono enucleato con l'aiuto di pinze curve, applicando una pressione al orbita.

Nota: Come al giorno postnatale 2, le ossa orbitali sono ancora cartilagineo, è importante non applicare troppa pressione durante il tentativo di rimuovere gli occhi.
Al contrario, nei topi adulti, le ossa orbitali sono ferme. Pertanto, al fine di enucleare gli occhi è sufficiente esercitare una pressione l'orbita senza allargare le fessure degli occhi in anticipo.

Parte 2: dissezione di retine murini embrionali, postnatale e adulta

Dissezione di retine

1. Gli occhi sono posti in una piccola scatola di Petri con PBS sterile e gli strati occhio circostanti vengono rimossi al microscopio di dissezione.
2. Per rimuovere gli strati esterni dell'occhio, nelle fasi post-natale e gli occhi degli adulti il ​​nervo ottico deve essere tagliato con l'aiuto di forbici primavera o fuori pizzicato da pinze più vicino possibile alla base il più possibile.
3. Girare l'occhio, in modo che la parte posteriore con il foro in cui il nervo ottico originariamente risiedeva ti sta di fronte. Inserisci nello spazio sottoretinico tra retina e dell'epitelio pigmentato con la punta delle due pinze molto fine dal luogo in cui il nervo ottico penetrare gli strati dell'occhio.
   
   Nota: Di solito, l'epitelio pigmentato può essere facilmente identificato dal suo colore scuro. In alcuni ceppi di topi mutanti - soprattutto negli animali albini - questo strato di pigmento può tuttavia essere colorati e quindi non può essere facilmente rilevare.
4. Rimuovere l'epitelio pigmentato con la membrana coroide attaccato e nella sclera con attenzione strappi su entrambi i lati con entrambe le pinze.
5. Staccare gli strati fino al livello della cornea, quindi girare l'oculare verso l'obiettivo e rimuovere la cornea con epitelio pigmentato, coroide membrana e nella sclera, tenendo la tazza rimanente della retina dal forcipe altri.
6. Afferrare il vitreo insieme alla piccola lente e mentre strappo con le pinze, tenere il wholemount retina in posizione con le pinze secondo.
   
   Nota: Quando la dissezione occhi embrionale, assicurarsi di rimuovere completamente il triangolare, tenda-come plesso capillare sotto il corpo vitreo con il vitreo.
   
   Nell'occhio adulto, il vitreo va rilevato ai lati e la cura deve essere presa per non forare il vitreo con le punte della pinza, come il suo contenuto è viscoso e si attacca alla pinza, ostacolando la sua rimozione.
7. Per organotipica cultura wholemount le tazze della retina sono raccolti in una piastra da 96 pozzetti contenente 200 ul Dulbecco modificato aquila medio (vedi sotto).

Nota: tra dissezione di retine individuale, mantenere la piastra a 96 pozzetti di raccolta contenente il terreno di coltura nell'incubatore, come il pH del terreno di coltura è innescata da CO ₂ attraverso il sistema carbonato.

Parte 3: murini wholemount organotipica retinacultura

1. Preparare 500 ml di cultura medio peso 7.8g Dulbecco modificato aquila / miscela di nutrienti F-12 HAM (DMEM) e 0,6 g NaHCO ₃ e dissoluzione sia in acqua MiIliQ. Regolare il pH a 7.15. Aggiungi 50mg apo-transferin, 50μl putrescin (stock: 60mg/ml), 50μl di selenio (stock: 52μg/ml), il progesterone (stock: 60μg/ml), e 2,5 ml di gentamicina (200 mm) sotto il cofano. Mescolare e filtrare attraverso un filtro superiore bottiglia. Immediatamente prima dell'uso aggiungere glutammina 10μl (200 mm) per mezzo di coltura ml.
   
   Nota: Questo terreno e siero-insulina-libero può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 2 settimane e utilizzati per esperimenti di induzione dell'apoptosi, come l'insulina non contrasta gli effetti. Se incubazione di wholemounts per più di 24 ore è desiderato e tassi di morte cellulare non saranno valutate, siero insulina (es. siero fetale di vitello; FCS) o gli integratori dovrebbero essere aggiunti per migliorare i tassi di sopravvivenza.
2. Prima di iniziare la cultura, la wholemounts retina sono pre-incubate per 15 minuti a 37 ° C con 200 ul caldo, pH equilibrato DMEM contenente ialuronidasi 0.5mg/ml di pre-digerire la ialuronidasi contenenti interno ed esterno della membrana limitante della glia M ller cellule, facilitando la penetrazione di sostanze applicate esogena.
3. Retine sono trasferiti ad un 24-pozzetti con il minor numero possibile ialuronidasi e colto come wholemounts organotipica in 2ml chimica definita media Dulbecco modificato aquila.
   
   Nota: Per il trasferimento della retina, utilizzare una pipetta 1ml e tagliare la punta della pipetta di pochi millimetri per ampliare l'apertura. Per gli occhi embrionale, da 200 microlitri puntale è sufficiente. I bordi di taglio dovrebbe essere dai lisci inserimento e torsioni di punta della pipetta secondo.
   Per 24-48 ore a breve termine le culture, tutte le misure possono essere eseguite al banco, ma se la contaminazione delle culture si rivela essere un problema, si dovrebbe lavorare sotto il cofano.
4. Le culture sono mantenuti per 24 - 48 ore a 37 ° C in un 5% di CO ₂ nell'atmosfera e ad esempio, sottoposti a trattamento farmacologico con fattori ricombinanti.

Parte 4: dissociazione di coltura wholemounts retina

1. Dopo il tempo desiderato cultura, retina sono raccolti in provette Eppendorf da 2 ml a fondo rotondo contenente 850 microlitri di PBS e 50 microlitri di siero albumina bovina (BSA; 30 mg / ml).
2. Luogo provette Eppendorf con retine in un blocco di riscaldamento, riscaldato a 37 ° C.
3. Aggiungere 25 microlitri collagenasi (200 U / ml) e 25 microlitri ialuronidasi (20mg/ml) a ciascuna provetta Eppendorf e iniziare a dissociare la retina in sospensione singola cella da 3 passa attraverso una pipetta Pasteur siliconata.
4. Tripsina aggiungere 10 microlitri (1mg/ml), attendere per 3-5 minuti, e poi lentamente pipetta 3-5 volte su e giù con siliconato pipetta Pasteur di dissociarsi meccanicamente i tessuti.
5. Aggiungere 10 microlitri DNasi I (5mg/ml), ancora una volta attendere per 3-5 minuti, poi lentamente pipetta 3-5 volte su e giù con siliconata pipetta Pasteur.
   
   Nota: Il tempo di incubazione per la dissociazione enzimatica varia e dipende dalla dimensione degli occhi e la fase di sviluppo, rispettivamente. Controllare la fase di digestione enzimatica del tessuto pipettando gentilmente su e giù.
6. Se la sospensione cellulare non è omogenea ormai, ma contiene ancora aggregati di cellule grandi, aggiungere altri 10 microlitri tripsina e 10 microlitri DNasi I.
7. Quando la sospensione cellulare è omogeneo, la digestione del tessuto viene fermato con l'aggiunta di 10 microlitri EDTA (0,5 M), tubi Eppendorf vengono rimossi dalla stufa e le sospensioni cellulari sono fissati per 1h aggiungendo 1 ml fresca, paraformaldeide ghiacciata 8% (PFA) a temperatura ambiente su una rotazione shaker.

Parte 5: Lavaggio delle sospensioni cellulari dissociato

1. La sospensione cellulare viene centrifugato per 5 minuti a 4 ° C e 0,2 rcf in una centrifuga di raffreddamento.
2. Il supernatante viene scartato e il pellet viene risospeso in 1ml PBS contenente BSA 3mg/ml.
3. Dopo aver ripetuto queste fasi di lavaggio due volte, il pellet viene infine risospeso in 500 microlitri di PBS contenente BSA 3mg/ml, 5mm EDTA e sodio azide allo 0,1%.

Nota: L'aggiunta di acido di sodio consentire l'archiviazione di sospensione cellulare per diversi giorni a 4 ° C. Tuttavia, se una colorazione immunocitochimica seguirà, non aggiungere l'acido di sodio al buffer di risospensione, come questo si traduce in perdita di qualità colorazione.

Parte 6: Cytospin di sospensioni cellulari per l'apoptosi e l'analisi quantitativa proliferazione

1. Un satinato-end vetrino da microscopio, un filtro cytospin con uno o due fori e un imbuto cytospin vengono inseriti in una clip scivolo cytospin. La clip scorrevole è chiuso e posizionato nel rotore cytospin.
2. La sospensione cellulare dissociato è omogeneizzato pipettando gentilmente su e giù.
   
   Nota: A seconda della fase di sviluppo della retina, la sospensione cellulare dalla procedura di dissociazione potrebbe essere necessarioessere diluito con PBS per ottenere un numero numerabile di cellule.
3. Un'aliquota (100 l), della sospensione cellulare viene applicata a un imbuto cytospin.
   
   Nota: Quando pipettaggio la sospensione cellulare per l'imbuto, la punta della pipetta dovrebbe raggiungere tutta la strada fino al fondo dell'imbuto. E 'importante non far passare il punto di pressione secondo pipetta in quanto ciò crea bolle d'aria, che sarà visibile nel punto cella dopo la cytospin e ostacola conta delle cellule.
4. La sospensione cellulare è depositata su un vetrino a 700 rpm per 7 min.
5. Per la determinazione degli effetti di fattori esogeni applicata sui livelli di apoptosi cellule possono essere colorate con 4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 2μg/ml), montato con fluorescente mezzo di montaggio. Cambiamenti nella apoptosi delle cellule può essere determinata contando almeno 1000 cellule (di cui almeno 10 nuclei pycnotic) in punti cella cytospin e il tasso di morte cellulare è calcolato come percentuale di cellule totale conta ^3,4.
   
   Nota: in alternativa, la distribuzione dei nuclei apoptotici possono essere valutati in flatmounts ³ o criostato sections4 di colture di wholemounts retina da TdT-mediata fine etichettatura dUTP nick (TUNEL).
6. Per il rilevamento della proliferazione delle cellule, BrdU (5 mM) possono essere aggiunte 6 ore prima della fine della cultura e della incorporazione di BrdU visualizzate in cytospins di omogenati cella colorazione immunocitochimica con un anticorpo anti-BrdU (ad esempio Developmental Studies Ibridoma Banca, Iowa, USA).
7. L'effetto del trattamento su diversi tipi di cellule della retina possono essere visualizzati in cytospins da anticorpi specifici come Brn3a neuroni (cellule gangliari marker) o opsina (fotorecettori marcatore) e di contrasto con DAPI.

Parte 7: Risultati Rappresentante

Figura 1: Passi in preparazione della murino wholemounts organotipica retina
Una testa di topo con entrambi gli occhi. B occhio murini con il lato alto lente, tutti i livelli ancora al suo posto. Dell'occhio C murini da parte posteriore con il nervo ottico ancora attaccato. Occhio D murini con sclera e dell'epitelio pigmentato parzialmente rimosso. E retina murini con epitelio della cornea, sclera e pigmento completamente rimossa, ma lenti e vitreo ancora al loro posto. F murini tazza retina wholemount con obiettivo e vitreo rimosso. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.

Figura 2: Analisi delle culture organotipica retina wholemount da cytospin e sezioni
Per l'analisi di apoptosi, cytospins di sospensioni cellulari dissociate sono macchiati dal DAPI e nuclei pycnotic possono essere distinte dalla frammentazione nucleare o condensazione della cromatina (punte di freccia in A). In alternativa, sezioni wholemount (CE; giorni retina murina postnatale (P) 2) o flatmount retina (F) può essere sottoposto a un test TUNEL e di contrasto con DAPI (E). L'effetto del trattamento su diversi tipi di cellule della retina possono essere visualizzati in cytospins neurone da anticorpi specifici come la cellula gangliare marcatore Brn3a (frecce in B) GCL, strato di cellule gangliari;. INL, prospettico strato interno nucleare. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.

Discussion

Il vantaggio di murine organotipica retina ^2-5 wholemount culture più di dissociazione, monostrato, culture 3D retinospheroid o ri-aggregati sferoidali ¹ risiede nella conservazione delle interazioni e connessioni neuronali, imitando la situazione in vivo. Rispetto ai rapporti precedenti ^2, il nostro articolo video fornisce una dimostrazione dettagliata delle peculiarità di enucleazione degli occhi murini e la dissezione di retine di varie fasi di sviluppo tra cui la rimozione del cristallino e del corpo vitreo, senza danneggiare la retina. La rimozione del cristallino e vitreo è essenziale per le manipolazioni farmacologiche sia come ostacolare l'accesso di sostanze agli strati della retina. A differenza di altri sistemi di espianto riferito murino cultura, non usiamo materiali di supporto, ad esempio le membrane in policarbonato ^2, per la nostra cultura organotipica, ma la cultura flottante libero le tazze della retina wholemount, inoltre facilitare l'accessibilità per via esogena sostanze applicate ^3-5.

Usando una chimica definita, siero e integrare senza terreno di coltura senza insulina permette solo per breve tempo la cultura (24 - 48 ore), ma controbilanciare gli effetti dell'insulina sui livelli di apoptosi ³ o fattore di crescita che imitano gli effetti di FCS e supplementi sono evitati.

La maggior parte apoptosi e studi proliferazioni uso MTT test o analisi FACS per la quantificazione degli effetti. Noi, invece, fornire una dimostrazione passo passo di dissociazione della retina coltivate per l'apoptosi e la proliferazione quantitativa analisi cytospin. Per quanto riguarda la nostra esperienza va, conteggio manuale dei nuclei in DAPI o macchie di cellule BrdU macchiato - anche se lungo e noioso - è il metodo più accurato per quantificare l'apoptosi e la proliferazione della retina, soprattutto nelle retine murini.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Animal	Charles River Laboratories
Dissection microscope	Tool	Carl Zeiss, Inc.
PBS	Reagent	Sigma-Aldrich		PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham	Reagent	Sigma-Aldrich	D 8900	DMEM / F-12
Apo-transferin	Reagent	Sigma-Aldrich	T 1147
Putrescin	Reagent	Sigma-Aldrich	P 5780
Sodium selenite	Reagent	Sigma-Aldrich	S 9133
Progesterone	Reagent	Sigma-Aldrich	P 6149
Gentamicine	Reagent	Invitrogen
L-Glutamine	Reagent	Invitrogen	25030-024	200 mM (100X), liquid
Bovine serum albumine (BSA)	Reagent	Carl Roth Gmbh	8076.3	30 mg/ml
Collagenase	Reagent	Sigma-Aldrich	C 0773	200 U/ml
Trypsin	Reagent	Sigma-Aldrich	T4799	From porcine pancreas; 1 mg/ml
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H 3884	200 mg/ml
DNase I	Reagent	Roche Group	1 284 932	10 mg/ml
EDTA	Reagent	Sigma-Aldrich	E 6511
Silicone solution	Reagent	SERVA Electrophoresis	35130
Paraformaldehyde (PFA)	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).
4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Reagent	Sigma-Aldrich	D 0542	DAPI
Fluorescent Mounting Medium	Reagent	Dako	S3023
BrDU	Reagent	Sigma-Aldrich	B 9285
96-well plates	Tool	Falcon BD	3072
24-well plates	Tool	Falcon BD	3047
Pasteur pipettes	Tool	Brand GmbH	747720
Forceps DUMONT #5	Tool	Fine Science Tools	11252-30	bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7	Tool	Fine Science Tools	11271-30	curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors,straight, 8cm	Tool	Fine Science Tools	15000-00	fine, small straight blades
Standard scissors, straight, sharp/blunt	Tool	Fine Science Tools	14007-14	Use for decapitation or cervical dislocation
Eppendorf tubes	Tool	Eppendorf		2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin
Cooling centrifuge	Tool	Eppendorf
Rotation shaker	Tool	CAT
Cytospin	Tool	Thermo Fisher Scientific, Inc.