Summary
Это видео статья демонстрирует создание органотипической сетчатки wholemount культур и процедуры цитоспина для анализа экзогенно индуцированных эффектов. Органотипической сетчатки wholemount культур имитировать
Abstract
Целевые абляции генов и анализ моделей на животных является классической стратегией для поступления конкретной функции сетчатки гена. Однако, трансгенные, сетчатки или конкретной условной модели нокаут мыши часто показывают ранние летальности или страдают от тяжелых пороков развития, предотвращения анализа за пределы эмбрионального или раннего постнатального этапа.
Первичные культуры клеток является альтернативой исследовать эффекты экзогенно применяются рекомбинантные факторы, избыточная экспрессия генов или миРНК опосредованного генной нокдаун в контролируемой среде. Расхождение между клеточной культуры имеет то преимущество, что эндогенные сигналы достижения целевых клеток уменьшается, тем самым облегчая идентификацию экзогенно срабатывает эффект после фармакологической манипуляции. Тем не менее, важно межклеточных взаимодействиях, первоначально уничтожены ферментативного пищеварения или механической диссоциации, даже если повторно агрегированных retinospheroid культур 1 используются.
С другой стороны, органотипической сетчатки wholemount культур обеспечивают системы, близкой к физиологической в естественных условиях ситуация с взаимодействием нейронов и связей до сих пор сохранились 2-5.
В этом видео мы предоставляем статье шаг за шагом демонстрации (1) создание в естественных условиях подобные органотипической сетчатки wholemount культур, включая вскрытие особенностей эмбрионального, послеродовой и взрослых мышиных глаз и (2) диссоциация и цитоспина процедуры для анализа нейронных апоптоза и пролиферации клеток сетчатки в органотипической wholemounts, например, после культуре в присутствии экзогенно применяются рекомбинантные факторы.
Protocol
Все оборудование и реагенты должны быть приобретены стерильные или должна быть тепла или пара стерилизации или стерилизуют 70% этанола.
Авторы утверждают, что эксперименты на животных были проведены в соответствии с Европейскими сообществами Директивы Совета (86/609/EEC), следующие руководящие принципы в отношении НИЗ уход и использование животных для экспериментальных процедур и правил, установленных Институциональные животных Уход и использование комитета (IACUC) в университете Дуйсбург-Эссен (Германия).
Часть 1: Энуклеация мышиных глазами разных стадиях развития
Энуклеация эмбриональных глаза
- Время беременных вязки создаются и утром того дня, когда вагинальные плагин обнаруживается в брачных женщин обозначен беременности 0 день.
- Беременные женщины приносят в жертву цервикальным сдвигом, когда развитие эмбрионов достигли желаемого этапе (здесь: эмбриональные сутки (E) 15) и фиксируется на воск борту 6.
- Брюшной стенки смоченной 70% этанола, разрезать вдоль средней линии и кожных лоскутов крепятся сбоку шпильками 6.
- Uterusses будут удалены из брюшной полости, отдельных и переносят в стакан с холодной PBS 6.
- Эмбрионов разделены, переданы в чашку Петри и матки стены и зародышевых оболочек удаляются тщательно с помощью щипцов 6.
- Эмбрионы погибают путем обезглавливания.
- Глаза энуклеированных быть использование тонких изогнутых щипцов, "пилинг" глаза от глаз.
Энуклеация послеродовых и взрослые глаза
- Молодые щенки погибают от обезглавливания, пожилые щенков и взрослых шейки дислокации.
- До послеродовом этапе P15, момент времени, когда мыши открыть глаза, глазные щели должны быть механически открыл применение щипцов и дополненное двумя поперечными разрезами веки с пружиной ножниц.
- Глаза извлекли ядра при помощи изогнутых щипцов, применяя давление на орбите.
Примечание: По состоянию на 2-й день послеродового, орбитальные кости до сих пор хрящевой, важно не применять слишком большое давление при попытке удалить глаз.
С другой стороны, у взрослых мышей, орбитальной кости фирмы. Таким образом, для того, чтобы выяснять глаза достаточно, чтобы оказать давление на орбиту без увеличения глаз щелей заранее.
Часть 2: Препарирование в зачаточном состоянии, послеродовой и взрослых мышиных сетчатки
Препарирование сетчатки
- Глаза помещаются в небольшой чашке Петри стерильной PBS и окружающих слоях глаз удаляют при вскрытии микроскопом.
- Для удаления внешних слоев глаза, в постнатальном этапах и взрослые глаза зрительного нерва должен быть отрезан при помощи ножниц или весной ущипнул от щипцов на как можно ближе к основе.
- Поверните глаза, так, что задняя сторона с отверстием, где зрительный нерв изначально проживали к себе. Введите субретинальной Пространство между сетчаткой и пигментным эпителием с наконечниками из двух очень тонких щипцов от места, где зрительный нерв проникает глаз слоями.
Примечание: Как правило, пигментный эпителий может быть легко определяется по его темным цветом. В некоторых мышей мутантных штаммов - особенно в белых животных - это пигментный слой может, однако, не быть окрашены и поэтому не могут быть легко обнаружить. - Удаление пигментного эпителия с прилагаемыми мембраны сосудистой оболочки и склеры, аккуратно разрывая в любую сторону и с щипцами.
- Снимите слоев до уровня роговицы, затем поверните глаза чашку в сторону объектива и удалить роговицы вместе с пигментным эпителием, сосудистой оболочки и склеры, в то время держит оставшиеся сетчатки чашку других щипцами.
- Возьмитесь стекловидного вместе с небольшим объективом и в то время как разрыв с щипцы, держать сетчатки wholemount на месте второго щипцами.
Примечание: При вскрытии эмбриональных глаза, убедитесь, чтобы полностью удалить треугольные, шатровой капиллярного сплетения под стекловидное тело вместе с стекловидного тела.
В взрослого глаза, стекловидного необходимо хватался за бока и уход должен быть внимательным, чтобы не проколоть стекловидного кончиками пинцета, как его содержание вязких и придерживается пинцетом, препятствуя его удаления. - Для органотипической wholemount культуры сетчатки чашки собраны в 96-луночного планшета, содержащие 200 мкл среды Дульбекко в модификации орла (см. ниже).
Примечание: В период вскрытия отдельных сетчатки, держать 96-луночного коллекции пластины, содержащей культуральной среды в инкубаторе, как рН культуральной среды вызвана CO 2 через карбонатные системы.
Часть 3: мышей органотипической сетчатки wholemountкультура
- Подготовка 500 мл культуры средний весовой 7.8g Дульбеко изменение орла / питательной смеси F-12 HAM (DMEM) и 0,6 г NaHCO 3 и растворения как в воде, MiIliQ. Отрегулируйте рН до 7,15. Добавить 50мг апо-трансферин, 50 мкл putrescin (складе: 60mg/ml), 50 мкл селенит натрия (складе: 52μg/ml), прогестерона (складе: 60μg/ml), и 2,5 мл gentamicine (200 мм) под капотом. Смешать и процедить через фильтр верхней бутылки. Непосредственно перед употреблением добавить 10 мкл глютамин (200 мм) в культуральной среде мл.
Примечание: Эта сыворотки и инсулина, свободных среду можно хранить при температуре 4 ° С в течение 2 недель и использовать для экспериментов индукции апоптоза как ни инсулина противодействует эффектам. Если инкубация wholemounts более чем на 24 часа желательно и темпы гибели клеток не будет оцениваться, инсулина сыворотки (например, эмбриональной телячьей сыворотки; ФТС) или дополнения должны быть добавлены к улучшению выживаемости. - Перед началом культуры, сетчатки wholemounts предварительно инкубировали в течение 15 мин при 37 ° С с 200 мкл теплой, рН-сбалансированный DMEM содержащие гиалуронидазу 0.5mg/ml предварительного переварить гиалуронидазы содержащие внутренней и наружной пограничной мембраны глии М Мюллер клетки, облегчая проникновение экзогенно применяются вещества.
- Сетчатки передаются в 24-луночный планшет с минимальными гиалуронидазы это возможно, и культивировали, как органотипической wholemounts в 2 мл химически модифицированный среда Дульбекко орла.
Примечание: Для передачи сетчатки, использовать 1 мл пипетки и сократить пипетки несколько миллиметров расширить отверстие. Для эмбрионального глаза, 200 мкл кончиком пипетки достаточно. Режущие кромки должны быть сглаживается путем вставки и закручивания второй наконечник пипетки.
За 24-48 часов краткосрочных культур, все шаги могут быть выполнены на скамейке, но если загрязнение культур оказывается проблема, должны работать под капотом. - Культур сохраняются в течение 24 - 48 часов при температуре 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы и, например, подвергается фармакологического лечения рекомбинантным факторов.
Часть 4: Диссоциация культурный сетчатки wholemounts
- После желаемой культуры время, сетчатки собираются в 2 мл труб Эппендорф с круглым дном, содержащую 850 мкл PBS и 50 мкл бычьего сывороточного альбуминовой (BSA, 30 мг / мл).
- Место Эппендорф труб с сетчатки в нагревательный блок, нагревается при температуре 37 ° C.
- Добавить 25 мкл коллагеназа (200 ед / мл) и 25 мкл гиалуронидазы (20mg/ml) в каждую пробирку Эппендорф и начать диссоциирующего сетчатки в суспензии отдельных клеток на 3 проходит через силиконизированный пипетки Пастера.
- Добавьте 10 мкл трипсина (1mg/ml), подождите 3-5 мин, а затем медленно пипетки 3-5 раз вверх и вниз с силиконизированный пипетки Пастера, чтобы механически отделить ткани.
- Добавьте 10 мкл ДНКазы I (5mg/ml), снова ждать в течение 3-5 мин, затем медленно пипетки 3-5 раз вверх и вниз с силиконизированный пипетки Пастера.
Примечание: инкубационный период для ферментативной диссоциации меняется и зависит от размера глаза и стадии развития, соответственно. Проверьте стадии ферментативного переваривания ткани, аккуратно пипетирования вверх и вниз. - Если клеточная суспензия не является однородным к настоящему времени, но все еще содержит основные агрегаты клетки, добавить дополнительные 10 мкл трипсина и 10 мкл ДНКазы I.
- Когда клеточная суспензия однородна, переваривание тканей останавливают добавлением 10 мкл ЭДТА (0,5 М), Эппендорф трубы удаляют из нагревателя и клеточные суспензии, фиксируются в течение 1 ч при добавлении 1 мл свежей, ледяной 8% параформальдегида (PFA) при комнатной температуре на шейкере вращения.
Часть 5: Стиральная диссоциированных клеточные суспензии
- Клеточной суспензии центрифугируют в течение 5 мин при 4 ° С и 0,2 RCF в охлаждении центрифуг.
- Супернатант удаляют, а осадок ресуспендировали в 1 мл PBS, содержащего 3мг/мл BSA.
- После повторения этих этапов промывки в два раза, гранул, наконец, ресуспендировали в 500 мкл PBS содержащего 3мг/мл BSA, 5 мМ ЭДТА и 0,1% азида натрия.
Примечание: добавление натрия кислота разрешать сохранение клеточной суспензии в течение нескольких дней при температуре 4 ° C. Однако, если иммуноцитохимического окрашивания будет следовать, не добавляйте натрия кислоты ресуспендирования буфера, так как это приводит к потере качества окрашивания.
Часть 6: цитоспина клеточной суспензии для количественного апоптоза и пролиферации анализ
- Матовое конца стекло микроскопа, цитоспина фильтра с одним или двумя отверстиями и воронки цитоспина вставлены в клип слайд цитоспина. Слайд клип закрывается и помещается в ротор цитоспина.
- Диссоциированных суспензии клеток гомогенизируют, осторожно пипетирования вверх и вниз.
Примечание: В зависимости от стадии развития сетчатки, клеточной суспензии из процедуры диссоциации, возможно, необходиморазбавлять PBS получить счетное число клеток. - Аликвоты (100 мкл) клеточной суспензии наносят на воронку цитоспина.
Примечание: При пипетирования клеточной суспензии в воронку, кончиком пипетки должна охватить все вплоть до нижней части воронки. Важно не протолкнуть вторую точку давления пипетки так как это создает пузырьки воздуха, которые будут видны в клетке место после цитоспина и препятствует клеток. - Клеточной суспензии выставляется на слайде при 700 оборотов в минуту в течение 7 мин.
- Для определения влияния экзогенно применяемых факторов на апоптоз уровне клетки могут быть окрашены с 4 ',6-Diamidino-2-фенилиндола (DAPI; 2μg/ml), установленного с люминесцентными монтажа среды. Изменения в апоптоз клеток может быть определен путем подсчета не менее 1000 клеток (содержащий, по меньшей мере, 10 pycnotic ядер) в пятнах цитоспина клеток и скорость гибели клеток рассчитывается в процентах от общего числа клеток насчитывает 3,4.
Примечание: Кроме того, распределение апоптоза ядер можно оценить в flatmounts 3 или криостат sections4 культурного сетчатки wholemounts по ТДТ-опосредованной dUTP ник конце маркировки (TUNEL). - Для обнаружения пролиферацию клеток, BrdU (5 мкМ) может быть добавлен 6 часов до окончания культуры и включение BrdU визуализированы в cytospins клеточных гомогенатах с помощью иммуноцитохимического окрашивания с помощью анти-BrdU антител (например, развитием исследований Гибридома банка, штат Айова, США).
- Эффект лечения на разных типах клеток сетчатки могут быть визуализированы в cytospins за нейроном специфических антител, как Brn3a (маркер ганглиозных клеток) или опсина (фоторецепторов маркер) и counterstaining с DAPI.
Часть 7: Представитель Результаты
Рисунок 1: Этапы подготовки мышиной органотипической сетчатки wholemounts
Глава мыши с обоими глазами. B мышей глаз с объективом вверх, все слои по-прежнему на месте. C мышей глаз от задней с зрительного нерва еще привязаны. D мышей глаза склеры и пигментный эпителий частично удаляется. E мышей сетчатки с роговицы, склеры и пигментный эпителий полностью удалена, но хрусталик и стекловидное-прежнему на месте. F мышей сетчатки wholemount чашку с хрусталик и стекловидное удалены. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
Рисунок 2: Анализ органотипической сетчатки wholemount культур цитоспина и секций
Для анализа апоптоза, cytospins диссоциированных суспензий ячейки окрашивали DAPI и pycnotic ядер можно отличить по ядерной фрагментации или конденсации хроматина (наконечники стрел, в). Кроме того, wholemount секций (CE; мышиной сетчатки послеродовой день (P) 2) или сетчатки flatmount (F) может быть подвергнут анализа TUNEL и контрастно с DAPI (E). Эффект лечения на разных типах клеток сетчатки могут быть визуализированы в cytospins за нейроном специфических антител, как ганглиозных клеток маркера Brn3a (стрелки в Б) GCL, слой ганглиозных клеток;. INL, потенциальные внутренний ядерный слой. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущество мышиной органотипической сетчатки wholemount культур на протяжении 2-5 диссоциации, монослой, retinospheroid или повторно агрегированных 3D сфероида культур 1 лежит в сохранении нейронных взаимодействий и связей, имитируя в естественных условиях ситуации. По сравнению с бывшим докладов 2, наше видео статья содержит подробные демонстрации особенностей энуклеации мышиных глаз и рассечение сетчатку различных стадиях развития, включая удаление хрусталик и стекловидное тело без повреждения сетчатки. Удаление хрусталика и стекловидного тела имеет важное значение для фармакологических манипуляций и как препятствовать доступу веществ слоев сетчатки. В отличие от других сообщила мышиной системы культуры эксплантов, мы не будем использовать вспомогательные материалы, например, поликарбонатные мембраны 2, для нашего органотипической культуры, а культура сетчатки wholemount чашки свободное плавание, кроме того, содействие доступности для экзогенно применяемых веществ 3-5.
Использование химического состава, сыворотки и дополнения среде без культуры, без инсулина позволяет лишь на короткое время культура (24 - 48 часов), но уравновешивающие действие инсулина на апоптоз уровней 3 или фактор роста, имитирующие эффекты ФТС и дополнения избежать.
Большинство апоптоза и пролиферации исследованиях используются МТТ анализов или FACS анализ для количественного определения эффектов. Мы, однако, предоставить шаг за шагом демонстрацию диссоциации культурный сетчатки для количественного апоптоза и пролиферации анализ цитоспина. Что же касается нашего опыта идет, ручной подсчет ядер в DAPI или BrdU окрашенные пятна клетки - хотя и утомительным и трудоемким - это наиболее точный метод для количественного сетчатки апоптоза и пролиферации, особенно в мышиной сетчатки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Э. де ла Роса и А. И. Valenciano для начальной помощи с созданием органотипической культур и У. Лауб и У. Герстер для оказания технической помощи.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Animal | Charles River Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBS | Reagent | Sigma-Aldrich | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma-Aldrich | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma-Aldrich | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma-Aldrich | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma-Aldrich | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma-Aldrich | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Carl Roth Gmbh | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma-Aldrich | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma-Aldrich | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma-Aldrich | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche Group | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma-Aldrich | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | SERVA Electrophoresis | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma-Aldrich | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma-Aldrich | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | Falcon BD | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | Falcon BD | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand GmbH | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Fisher Scientific, Inc. |
References
- Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -F., Layer, P. G. Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure. Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
- de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. Organoculture of the chick embryonic neuroretina. Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works. J Vis Exp. 32, (2009).
