Summary
قدرة الخلايا الجنينية جرثومي على التمايز إلى خلايا جرثومي البدائية خلال مراحل النمو المبكر هو نموذج مثالي لمعالجة فرضيتنا حول السرطان والعقم. هذا البروتوكول يوضح كيفية عزل خلايا جرثومي البدائية من المناسل النامية في الأجنة 10،5-11،5 أيام آخر coitum الماوس.
Abstract
قدرة الخلايا الجنينية جرثومي (مصر) على التمايز إلى خلايا بدائية جرثومي (PGCs) ولاحقا في الأمشاج خلال مراحل النمو المبكرة هو نموذج مثالي لمعالجة فرضيتنا حول السرطان والعقم. هذا البروتوكول يوضح كيفية عزل خلايا جرثومي البدائية من المناسل النامية في آخر أيام 10،5-11،5 الأجنة coitum الماوس (DPC). النامية التلال الغدد التناسلية من أجنة الفئران (C57BL6J) تم فصلها عن اضطراب الميكانيكية مع كولاجيناز ، ثم في مطلي بطبقة جنين الفأر تغذية الخلايا الليفية (MEF - CF1) الذي كان سابقا مع المعطل mitotically C mitomycin في حضور وسائل الإعلام وتستكمل مع خروج المغلوب المانع اللوكيميا عامل (LIF) ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، والخلية الجذعية عامل (SCF). باستخدام هذه الأساليب الأمثل لتحديد PCG ، والعزلة ، وتهيئة الظروف ثقافة تصاريح الثقافات على المدى الطويل من الخلايا المصري لأكثر من 40 يوما. وأظهرت خطوط الخلايا الجنينية جرثومي النمط الظاهري الجنينية والتعبير عن علامات مشتركة تستخدم الدولة المحفزة. العزلة واشتقاق خلايا جرثومي في الثقافة توفير أداة لفهم تنميتها في المختبر ، وتتيح الفرصة لرصد الأضرار المتراكمة على المستويات الجينية واللاجينية بعد التعرض لالاكسدة.
Protocol
الجزء 1 : الحوامل البطن ماوس
- خلع به عنق الرحم ، والموت ببطء ماوس C57BL6J الإناث الحوامل في DPC 10،5-11،5.
- تنظيف البطن مع الصابون المضادة للميكروبات ، ثم حلقها.
- بعد الحلاقة ، وغسل البطن بمحلول ملحي.
- ثم جافة والبطن مع شاش معقم.
- تغطية الفأر مع حقل معقمة جديدة.
- جعل شق بطني باستخدام ملقط ومقص تشريح.
- تحديد وإزالة الرحم بأكمله من تجويف البطن. وسوف تكون مرئية أجنة الفئران داخل الرحم.
- نقل الرحم في طبق بتري مليئة مد برنامج تلفزيوني ، وابقائه على الجليد.
- باستخدام مشرط معقم وملقط ، إزالة المشيمة والأنسجة الجنينية اضافية لكل جنين.
- نقل الأجنة في طبق بتري جديدة مليئة D - PBS.
- قياس طول أجنة الفئران. وجدنا أن أحجام تختلف تبعا لعمر الجنين. قياس 10.5 DPC على سبيل المثال 8.5 DPC يقاس بمتوسط 6mm ، بمتوسط 11mm ، و 12.5 DPC يقاس بمعدل 16 ملم.
- ثم ، إزالة ذيولها لاستخراج الحمض النووي.
الجزء 2 : الغدد التناسلية تشريح ريدج
وبموجب stereomicroscope مصدر الضوء Fostec شوت
- وضع ورقة تصفية في طبق بتري. ثم وضع الجنين الماوس على أعلى ورقة الترشيح لتجفيف الجنين وشل للتشريح.
- باستخدام مشرط معقم ، وجعل قطع عرضية من جنين فأر فوق المنشأ من الحبل السري.
- تحت stereomicroscope ، وذلك باستخدام ملقط معقم وغرامة إبرة معقمة إغاظة غرامة ، وإزالة الأمعاء والكبد بحيث الجهاز البولي مرئيا.
تقع الكلى أفقيا في تجويف البطن ، ويقع في المثانة الإنسي والذيلية بالمقارنة مع الكليتين. يمكن التعرف على الجنين ذكرا لأن تقع الغدد التناسلية التلال على جانبي المثانة. في الأنثى ، وترد بحزم التلال الغدد التناسلية لانهاء الوحشي الذيلية الكلى. - قشر خارج التلال الغدد التناسلية عن طريق تحريك إبرة وراء ذلك. تتم إزالة الحرف الغدد التناسلية عن طريق خفض بعيدا الأنسجة التي تعتمد عليه.
- نقل التلال الغدد التناسلية إلى طبق بتري جديدة مليئة الطازجة D - PBS.
المجهر ، يجب أن يكون الحرف الذكور الغدد التناسلية جردت ، كبيرها وبيضاوية الشكل. في المقابل ، ينبغي أن رصدوا الحرف الإناث الغدد التناسلية ، وقد شكل طولي وتكون أصغر بالمقارنة مع الحرف والغدد التناسلية للذكور.
الجزء 3 : الغدد التناسلية الهضم ريدج
تحت stereomicroscope :
- Mesonephros تشريح : فصل الغدد التناسلية من mesonephros والحرف باستخدام إبرة رفيعة وحادة.
- ومن المهم لإزالة mesonephros من التلال الغدد التناسلية لأنه هو نسيج الجسدية التي سوف اكتسى في عملية الاشتقاق PGC.
- الغدد التناسلية الهضم ريدج : جمع التلال الغدد التناسلية النظيفة في انخفاض 0.5ul العذبة D - PBS. إضافة 20 مل من كولاجيناز / Dispase محلول (تركيز النهائي في 1mg/ml).
- وينبغي معالجة الأجنة بشكل فردي. وينبغي أن يكون لكل جنين الخاصة طبق بيتري منفصل وصفت.
- الغدد التناسلية ريدج الثرم : قص الحرف الغدد التناسلية الى قطع صغيرة باستخدام إبرة معقمة وملقط معقم غرامة رقم 4.
- الحضانة : أن يتم نقل أطباق بتري لحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- يمكن أن فترة حضانة تتراوح بين الأنسجة.
- Pipetting : بعد 15 دقيقة ، والأنسجة يمكن فصلها عن طريق pipetting. باستخدام ماصات زجاجية سحبت الشعرية بأقطار بين 40 ملم -100 تفكك القطع التي pipetting صعودا وهبوطا. وهذا شكل كتل صغيرة. نقل كتل 0.5ml لهبوط قبل D - PBS استعد لغسل النهائي.
- بعد الغسيل ، نقل كتل لأنابيب إيبندورف.
- لا تعرض على الأنسجة لكولاجيناز.
- لا تجعل تعليق خلية واحدة. هذا هو المهم لتكوين مستعمرة. إذا كان تعليق خلية واحدة ، PGCs تميل إلى التفريق والهجرة.
- وينبغي أن لا تكون هذه العملية وقتا أطول من 20 دقيقة ، أو خلايا الخاص بك وسوف تفقد قدرتها على البقاء.
- الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الطرد المركزي ، وإزالة طاف ، وresuspend الكرية في 0.5 مل من يطرق تستكمل بها وسائل الاعلام (ما قبل حرارة بلغت 37 درجة مئوية).
الجزء 4 : البدائي الثقافة خلايا بيرشوت
"يجب تنفيذ الخطوات التالية بسرعة للحفاظ على استمرارية PGCs عن العزلة والاشتقاق.
- قبل 24 ساعة من هذه العملية يجب أن تعد المعطل mitotically MEF - CF1 تغذية الطبقة التالية من البروتوكول تشانغ جي وآخرون 2008.
- إعداد أطباق لمدة 20 pregnaNT الإناث الماوس (6-8 أجنة).
- MEFs يفقد القدرة على أن تكون طبقة وحدة التغذية (تعزيز النمو ومنع التمييز) بعد 5-6 الممرات.
- لا تستخدم MEFs مضى عليها أكثر من 48 ساعة.
- مباشرة قبل PGCs الطلاء ، لا بد من إزالة ببطء MEF المتوسطة من الطبقة المغذية MEF.
- ثم ، يضاف 0.5 مل / جيدا قبل حرارة متوسطة استكمال خروج المغلوب على طبقة MEF المغذية.
- MEF الوسائط تحتوي مصل بقري جنيني الذي يؤدي الى التفريق بين PGCs.
- ويجب أن يكمل المتوسطة خروج المغلوب مع عوامل النمو مسكوكة المحددة على الفور قبل استخدامه للتأكد من نشاط عامل النمو.
- باستخدام توزيع متناظرة ، PGCs وحة فوق طبقة MEF المغذية.
- إذا كانت هذه القطع هي قريبة جدا ، فإنها تميل إلى تجميع وجعل المستعمرات الكثيفة التي تربط سيئة أو تبدأ التفرقة.
- يجب أن يكون المسمى الأطباق الثقافة مع الخلية الجنينية بيرشوت اسم الخط ، ورقم المرور ، والتاريخ.
- بعناية ، ونقل الأطباق الثقافة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- رصد خلايا كل 24 ساعة.
- بعد 48 ساعة ، وإزالة 250 مل من وسائل الإعلام من أعلى جدا من الثقافة لتجنب القلق تعلق المستعمرة. ثم ، يضاف 250 مل من جديد وسائل الاعلام خروج المغلوب تستكمل (ما قبل حرارة بلغت 37 درجة مئوية).
- بعد الخطوة 7 ، انتظر 48 ساعة أخرى ، ثم إزالة جميع وسائل الإعلام واستبدالها جديدة تستكمل وسائل الاعلام خروج المغلوب (ما قبل حرارة عند درجة 37). تفعل ذلك كل يوم لمدة 8-10 2 أيام حتى شكل مستعمرات PGC.
الجزء 5 : خلايا الجنينية بيرشوت
- بعد 10 يوما من العزلة PGC ، تتشكل الخلية الجنينية المستعمرات جرثومي.
- تبقى الخلية الجنينية جرثومي على قيد الحياة عن طريق الممرات دليل كل يوم 8-10. استمروا في تقديم التشكل غير متمايزة والتعبير عن علامات تعدد القدرات مثل الفوسفاتيز alkalyne أكتوبر - 4 ، SSEA - 1 ، وSOX 2
تلاحظ
- ظروف معقمة / العقيم ضرورية في غرفة الثقافة.
- لاشتقاق والثقافة ، وتتم معالجتها في مجلس الوزراء PGCs منقيات الفئة الثانية السلامة الحيوية.
- حضانات هي في ترطيب 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 الحاضنة.
- يتم تصفية جميع وسائل الإعلام والكواشف قبل استخدامها في تصفية 0،2 ميكرون ، وتخزينها في 4 درجات مئوية ، وقبل حرارة بلغت 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- أثناء تشريح الخطوات ، يجب أن تظل جميع الأجنة والأنسجة على الجليد.
- يتم تطهير جميع القوارير كاشف مع الايثانول قبل وضعه في خزانة.
- استعمال القفازات ، معطف المختبر ، وقبعات ممرضة إلزامية.
استنتاج
لقد قدمنا الفيديو الذي يظهر لك كيفية عزل واستخلاص ، والثقافة الخلايا الجنينية من التلال جرثومي الغدد التناسلية من 10،5-11،5 DPC أجنة الفئران. عزلة استنساخه وطويلة الأجل للثقافة خطوط الخلايا الجنينية جرثومي يوفر أساسا حاسما لدراسة التطور الجنيني المبكر ، وأنماط وراثية وجينية جرثومي ، وتشكيل الغدد التناسلية ، والآثار البيئية الناجمة عن الأجهزة المحيطة بها خلال العملية التنموية من تكون الأعراس في أجنة من الذكور والإناث ، وتحديد المسارات التي تؤدي إلى الإصابة بالسرطان والعقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أجري هذا البحث بعد استعراض والمؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (IACUC) الموافقة على بروتوكول لدينا الماوس # 08030 (دور أنواع الأكسجين التفاعلية ، ريوس في تطوير خط الجرثومية وتكوين الورم : القابضة وتربية البروتوكول) في جامعة ولاية ميسيسيبي.
Acknowledgments
فإن الكتاب أن نعترف مساعدة لا تقدر بثمن من : الدكتور نيل الأولى ويلكنسون Kourtney للتحرير المخطوط ، والدكتورة لوسي سنتر ، والدكتور Willeford بريجيت ومايك Basett للمساعدة في تدريب ورعاية الحيوان في جامعة ولاية ميشيغان مرفق ALAC الماوس المعتمدة ، والدكتور دواين وايز للحصول على المساعدة مع المجهري والتقاط الصور ؛ سيزار مونروي ، Swoope هانا ، وبوبي هدلستون لمساعدتها في إنتاج الفيديو في جامعة ولاية ميشيغان. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب البحوث المؤسسية وإدارة العلوم البيولوجية في جامعة ولاية ميسيسيبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10.5 - 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | |||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | |
| Collagenase /Dispase Solution | Roche Group | 269638 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Mitomycin C | Sigma-Aldrich | M4287 | |
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | |
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | |
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | |
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | |
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercapt–thanol Sigma Catalogue Number: M7522 | |
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | |
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | ||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | |
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher Scientific | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
| Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes. Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. |
|||
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. |
|||
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. |
|||
| Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. | |||
References
- DeFelici, M. Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, Second Edition, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
- Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs. J Vis Exp. , (2008).
