小鼠胚胎生殖细胞的分离和推导

Summary

胚胎生殖细胞分化成原始生殖细胞在早期发展阶段的能力，是一个完美的模型，以解决我们的假设，对癌症和不育症。该协议显示了如何从发展中国家性腺的原始生殖细胞中分离出来后10.5-11.5天coitum小鼠胚胎。

Abstract

胚胎生殖细胞的能力（例如），以区分在早期发育阶段，是一个完美的模型，以解决我们的假设，对癌症和不育症的原始生殖细胞（PGCS），后来进入配子。该协议显示了如何在10.5-11.5天coitum（DPC）的小鼠胚胎来自发展中国家性腺的原始生殖细胞分离。发展中国家从小鼠胚胎性腺脊（C57BL6J）分离机械破碎与胶原酶，然后镀上了一个小鼠胚胎成纤维细胞饲养层（MEF - CF1）以前分裂与丝裂霉素C灭活淘汰赛媒体的存在，并辅以白血病抑制，因子（LIF），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），干细胞因子（SCF）。使用这些优化方法盈科鉴定，隔离，并建立培养条件允许超过40天，EG细胞的长期培养。胚胎生发细胞株显示胚胎的表型多能状态的常用标记和表达。文化的生发细胞的分离和衍生提供了一个工具，以了解体外他们的发展提供了机会，在遗传和表观遗传一级监察累积损伤后接触氧化应激。

Protocol

第1部分：孕鼠剖腹

1. 使用颈椎脱位，安乐死在10.5-11.5 DPC怀孕C57BL6J雌性小鼠。
2. 抗菌肥皂与清洁腹部，然后，刮胡子。
3. 剃须后，用生理盐水溶液冲洗腹部。
4. 然后，用无菌纱布擦干腹部。
5. 盖鼠标与一个新的无菌领域。
6. 制作腹切口，使用镊子和解剖剪刀。
7. 识别和清除腹腔整个子宫。小鼠胚胎将子宫内可见。
8. 转移到培养皿中弥漫着的D - PBS的子宫，并保持它在冰上。
9. 使用无菌手术刀和镊子，取出每个胚胎的胎盘和多余的胚胎组织。
10. 转移到培养皿填充的D - PBS新鲜菜的胚胎。
11. 测量长度的小鼠胚胎。我们发现，根据胚胎的年龄大小不同。例如8.5 DPC测量平均为6mm，10.5 DPC测定平均为11mm，平均为16毫米测量和12.5 DPC。
12. 然后，去除DNA的提取它们的尾巴。

第2部分：性腺岭夹层

在体视显微镜和光源肖特Fostec

1. 放置在培养皿滤纸。然后，将滤纸上的小鼠胚胎干的胚胎和固定解剖。
2. 用消毒的手术刀，使以上横向切断脐带来源的小鼠胚胎。
3. 立体显微镜下，用无菌的罚款钳和无菌罚款戏弄针，去除肠子和肝脏，泌尿系统是可见的。
   在腹腔，肾脏位于横向比较肾脏和膀胱位于内侧和尾鳍。胚胎可以被认定为男性，因为性腺脊位于膀胱两侧。在女性，性腺脊牢固地附着在肾脏尾外侧端。
4. 剥离性腺脊出它背后的滑动针。削减了支持它的组织的性腺脊被删除。
5. 性腺脊转移到一个新的充满新鲜的D - PBS的培养皿。
   显微镜下，男性性腺脊应剥离，大和椭圆形。相比之下，女性性腺脊应被发现，有长形和男性性腺脊比较小。

第3部分：性腺岭消化

在体视显微镜：

1. 中肾解剖：分开，性腺中肾和使用罚款和尖锐的针脊。
   • 这一点很重要，因为它是一个体组织在PGC的推导过程，将长满删除从性腺嵴中肾。
2. 性腺岭消化：0.5ul新鲜的D - PBS下​​降收集在一个干净的性腺脊。添加20毫升胶原酶/ Dispase溶液（1mg/ml的最终浓度）。
   • 胚胎应单独处理。每个胚胎应该有自己的独立和标记的培养皿。
3. 性腺岭切碎：使用消毒针头和无菌细镊子4号，剪切成小块性腺脊。
4. 孵化：培养皿中转移到孵化器在37 ° 15分钟。
   • 潜伏期的时间可能会有所不同组织之间。
5. 移液：15分钟后，组织可以通过移液分离。使用直径40 -100毫米之间，突破拉升的玻璃毛细管移液器吹打向上和向下的。这将形成小团块。将团块一个前预热的D - PBS作最后洗的下降0.5毫升。
6. 洗涤后，转移到Eppendorf管的团块。
   • 不要过分暴露的组织，以胶原酶。
   • 不要做一个单细胞悬液。这是很重要的的集落形成。如果它是一个单细胞悬液，PGCS倾向于分化和迁移。
   • 这个过程应该不会超过20分钟，或你的细胞就会失去生存能力。
7. 在室温下5分钟在2000转离心。
8. 离心后，取出上清液，重悬在0.5毫升补充敲了媒体（在37 ° C预热）沉淀。

第4部分：元文化的生殖细胞

“你应该迅速执行下一个步骤，以维护隔离和推导PGCS的可行性。

1. 24小时之前，这个过程中，你要准备一个分裂灭活MEF - CF1的饲养层，J.等2008张以下的协议。
   • 准备之一孕20菜NT雌性小鼠（6-8胚胎）。
   • MEFs失去的能力是一个饲养层后5-6代（促进经济增长和防止分化）。
   • 不要使用MEFs超过48小时以上。
2. 电镀前立即PGCS，MEF的介质必须慢慢从MEF饲养层。
3. 然后，添加0.5毫升/孔的预热补充到MEF饲养层的淘汰赛介质。
   • MEF媒体含有胎牛血清诱导分化的PGCS。
   • 淘汰赛介质必须辅以实物特异性生长因子之前使用，以确保生长因子的活性。
4. 使用对称的分布在MEF饲养层，板PGCS。
   • 如果这些作品的距离太近，他们往往聚集密集菌落附着不佳或开始区分。
   • 培养皿必须标有胚胎生发细胞系的名称，传代次数，和日期。
5. 小心地转移到孵化器在37 ° C和5％的CO ₂的培养皿。
6. 每24小时监控的细胞。
7. 48小时后，取出250毫升的媒体，从文化的最上方，以避免令人不安的殖民地的附件。然后，添加250毫升的新鲜补充淘汰媒体（在37 ° C预热）。
8. 第7步后，再等待48小时，然后，彻底清除所有媒体和更换新鲜补充淘汰的媒体（在37 ° C预热）。这样做，每2天为8-10天，直到PGC的殖民地形式。

第5部分：胚胎生殖细胞

1. PGC的隔离10天之后，胚胎生发细胞集落形成。
2. 胚胎生发细胞株是由手动通道，每8-10天保持活着。他们继续提出的未分化的形态及表达多能性标志物，如alkalyne磷酸，10月4，SSEA - 1，和SOX - 2

注释

• 无菌/无菌条件下，在文化室至关重要。
• 推导和文化，PGCS在净化器II级生物安全柜处理。
• 孵化在加湿37 ° C和5％ _二氧化碳培养箱。
• 被过滤掉所有的媒体和试剂，使用前先在一个0.2微米的过滤器保存在4 ° C，并预热，使用前在37 ° C。
• 在清扫的步骤，所有的胚胎和组织必须保持在冰上。
• 所有的试剂瓶中，放置在柜前用乙醇净化。
• 手套，白大褂和护士帽的使用是强制性的。

结论

我们已经提供了一个视频将告诉您，如何隔离，推导，文化10.5-11.5 DPC小鼠胚胎性腺脊的胚胎生殖细胞。胚胎生发细胞系的重现性隔离和长期的文化，提供了一个研究早期胚胎发育，遗传和表观遗传的生发模式，性腺形成的关键基础，在配子发生在男性和女性胚胎发育过程中，周围脏器的环境影响确定的途径，导致癌症和不育症。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10.5 - 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse.
Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC		SCRC-1040
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Invitrogen	14190/086
Collagenase /Dispase Solution	Roche Group	269638
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M4287
Trypsin EDTA	Invitrogen	25200-072
MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose	Invitrogen	10566024
10% Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000/044
1% of antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096
Knockout Media: 80% knockout D-MEM	Invitrogen	10829/018
20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen		25130/081	with β-mercapt–thanol Sigma Catalogue Number: M7522
1X non essential amino acid solution	Invitrogen	11140/050
1% antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096	supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106
40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech		250-03
20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF)	Invitrogen	13256-029
Corning center well culture dish 60mm	Fisher Scientific	07-200-79	1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes
Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes. Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.