Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

Summary

Het vermogen van embryonale kiemcellen om in primordiale kiemcellen differentiëren tijdens de vroege ontwikkelingsstadia is een perfect model om onze hypothese te pakken over kanker en onvruchtbaarheid. Dit protocol laat zien hoe primordiale kiemcellen van de ontwikkeling van gonaden isoleren in 10.5-11.5 dagen na coitum muizenembryo's.

Abstract

Het vermogen van embryonale kiemcellen (EG) om te differentiëren in primordiale kiemcellen (PGC) en later in de gameten tijdens de vroege ontwikkelingsstadia is een perfect model om onze hypothese te pakken over kanker en onvruchtbaarheid. Dit protocol laat zien hoe primordiale kiemcellen van de ontwikkeling van gonaden isoleren in 10.5-11.5 dagen na coitum (DPC) muizenembryo's. Het ontwikkelen van gonadale richels van muis embryo's (C57BL6J) zijn gedissocieerd door een mechanische storing met collagenase, en afgewerkt in een muis embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) die eerder mitotisch was met mitomycine C geïnactiveerd in de aanwezigheid van knock-out media en aangevuld met leukemie Inhibitor Factor (LIF), basic fibroblast groeifactor (bFGF), en Stem Cell Factor (SCF). Met behulp van deze geoptimaliseerde methoden voor PCG identificatie, isolatie, en de vestiging van de kweekomstandigheden vergunningen op lange termijn culturen van EG-cellen voor meer dan 40 dagen. De embryonale germinale cellijnen toonde embryonale fenotype en expressie van de gemeenschappelijke gebruikte markers van de pluripotente staat. Isolatie en afleiding van germinale cellen in de cultuur een middel om hun ontwikkeling te begrijpen in vitro en bieden de mogelijkheid om cumulatieve schade monitor genetische en epigenetische niveaus na blootstelling aan oxidatieve stress.

Protocol

Deel 1: Zwanger Mouse Laparotomie

1. Met behulp van cervicale dislocatie, euthanaseren een zwangere C57BL6J vrouwelijke muis op 10,5-11,5 DPC.
2. Maak de buik met antimicrobiële zeep, en dan, scheer het.
3. Na het scheren, wassen de buik met een zoutoplossing.
4. Dan, droog de buik met een steriel gaasje.
5. Bedek de muis met een nieuwe steriele veld.
6. Maak een ventrale incisie met behulp van een tang en dissectie schaar.
7. Identificeren en te verwijderen van de gehele baarmoeder uit de buikholte. Muis embryo's zullen zichtbaar zijn in de baarmoeder.
8. Overdracht van de baarmoeder in een petrischaal gevuld met D-PBS, en houd het op ijs.
9. Met behulp van een steriele scalpel en pincet, verwijder de placenta en extra embryonale weefsels van elk embryo.
10. Transfer embryo's in een frisse petrischaal gevuld met D-PBS.
11. Meet de lengte van de muis embryo's. We vonden dat de maten verschilden op basis van de embryo's leeftijd. Bijvoorbeeld 8,5 dpc gemeten op een gemiddelde van 6 mm, 10,5 dpc gemeten op een gemiddelde van 11mm, en 12,5 DPC gemeten op een gemiddelde van 16 mm.
12. Verwijder vervolgens hun staart voor DNA-extractie.

Deel 2: Gonadale Ridge Dissection

Onder stereomicroscoop en Lichtbron Schott Fostec

1. Plaats een papieren filter in een petrischaal. Vervolgens plaatst u de muis embryo op de top van het filter papier naar de embryo drogen en voor dissectie immobiliseren.
2. Met behulp van een steriel scalpel, maken een dwarse snede van de muis embryo boven de oorsprong van de navelstreng.
3. Onder een stereomicroscoop, met steriele fijne pincet en een steriele naald fijne plagen, dus verwijder de darmen en de lever dat de urinewegen zichtbaar is.
   De nieren zijn zijdelings gelegen in de buikholte, en de blaas is gelegen mediaal en caudaal in vergelijking met de nieren. Het embryo kan worden geïdentificeerd als man, omdat de gonadale richels bevinden zich aan weerszijden van de blaas. Bij de vrouw zijn de gonadale richels stevig aan de caudale laterale einde van de nieren.
4. Schil de gonadale kam door een naald te schuiven achter de rug. De gonadale ridge wordt verwijderd door het wegsnijden van de weefsels die dit ondersteunen.
5. Breng de gonadale richels om een ​​nieuwe petrischaal gevuld met verse D-PBS.
   Microscopisch, moeten de mannelijke gonadale nok worden gestript, groot en ovaal van vorm. In tegenstelling tot de vrouwelijke gonadale nok moet worden gezien, zijn langgerekte vorm en kleiner zijn in vergelijking met de mannelijke geslachtshormonen nok.

Deel 3: Gonadale Ridge Spijsvertering

Onder stereomicroscoop:

1. Mesonephros Dissection: Haal de gonaden van de mesonephros en nok met een fijne en scherpe naald.
   • Het is belangrijk om de mesonephros te verwijderen uit de gonadale nok want het is een somatische weefsel dat zal overwoekeren in het PGC afleiding proces.
2. Gonadale Ridge Spijsvertering: Verzamel schone gonadale richels in een 0.5ul daling van verse D-PBS. Voeg 20 ml Collagenase / Dispase Solution (Final concentratie 1mg/ml).
   • Embryo's moet individueel worden verwerkt. Elk embryo moet zijn eigen aparte en gelabeld petrischaal.
3. Gonadale Ridge dribbelen: Snijd de gonadale nok in kleine stukjes met behulp van een steriele naald en steriele fijne tang nr. 4.
4. Incubatie: petrischalen worden overgebracht naar een incubator bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
   • De incubatietijd kan variëren tussen de weefsels.
5. Pipetteren: Na 15 minuten wordt het weefsel kan gescheiden worden door pipetteren. Met behulp van getrokken glas capillair pipetten met een diameter tussen de 40 -100 mm Verdeel de stukken door en neer te pipetteren. Dit zal kleine bosjes. Breng de klompen aan 0,5 ml van een vooraf verwarmde D-PBS laten vallen voor een laatste wasbeurt.
6. Na het wassen, overdracht van de klompen aan eppendorf buizen.
   • Niet over het weefsel bloot aan collagenase.
   • Maak geen enkele celsuspensie. Dit is belangrijk voor de kolonie de vorming. Als het een enkele celsuspensie, PGC's hebben de neiging om te differentiëren en te migreren.
   • Dit proces mag niet langer dan 20 minuten, of je cellen zal verliezen levensvatbaarheid.
7. Centrifugeer bij 2000 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
8. Na centrifugeren, verwijder het supernatans, en resuspendeer de pellet in 0,5 ml aangevuld knock-out media (Pre-verwarmd bij 37 ° C).

Deel 4: Primordial Germinal Cellen Cultuur

"Je moet snel uit te voeren de volgende stappen uit om de levensvatbaarheid van PGC's voor de isolatie en afleiding te behouden.

1. 24 uur voordat dit proces moet je voor te bereiden een mitotisch geïnactiveerd MEF-CF1 feeder layer volgens het protocol van Zhang J. et al., 2008.
   • Bereid je 20 gerechten voor een pregnant vrouwelijke muis (6-8 embryo's).
   • MEF verliezen de mogelijkheid om een ​​feeder laag zijn (de groei te bevorderen en te voorkomen dat differentiatie) na 5-6 passages.
   • Gebruik geen MEFs ouder is dan 48 uur.
2. Onmiddellijk voorafgaand aan plating PGC's, moet de MEF medium langzaam worden verwijderd van de MEF feeder-laag.
3. Voeg vervolgens 0,5 ml / putje van de voorverwarmde aangevuld met knock-out medium op de MEF feeder-laag.
   • MEF media bevat foetaal runderserum dat differentiatie van de PGC's induceert.
   • Knockout medium moet worden aangevuld met specie specifieke groeifactoren onmiddellijk voor gebruik om de activiteit van de groei factor te verzekeren.
4. Met behulp van symmetrische verdeling, plaat PGC's over de MEF feeder-laag.
   • Als deze stukken zijn te dicht, ze de neiging te aggregeren en maken dichte kolonies die slecht hechten of beginnen differentiëren.
   • Cultuur gerechten moeten worden geëtiketteerd met Embryonale Germinal cellijn naam, passage nummer en datum.
5. Voorzichtig, overdracht van de cultuur gerechten in een incubator bij 37 ° C en 5% CO _2.
6. Monitor de cellen elke 24 uur.
7. Na 48 uur verwijdert 250 ml van media uit de top van de cultuur om te voorkomen dat verstoring van de kolonie bijlage. Dan, voeg 250 ml vers aangevuld met knock-out media (voorverwarmd bij 37 ° C).
8. Na stap 7, wacht nog 48 uur, en daarna, volledig te verwijderen alle media en vervang deze door verse aangevuld knock-out media (voorverwarmd bij 37 ° C). Doe dit om de 2 dagen voor 8-10 dagen tot de PGC kolonies te vormen.

Deel 5: Embryonale Cellen Germinal

1. Na 10 dagen van PGC isolatie, zijn embryonale germinal cel kolonies gevormd.
2. Embryonale germinale cellijnen worden in leven gehouden door handmatige passages elke 8-10 dagen. Ze blijven een ongedifferentieerde morfologie huidige en pluripotentie markers, zoals alkalyne fosfatase, Oct-4, SSEA-1, en SOX-2 express

Opmerkingen

• Steriele / aseptische omstandigheden zijn essentieel in de cultuur van ruimte.
• Voor de afleiding en cultuur, zijn PGC's verwerkt in een Purifier klasse II Bio veiligheid kabinet.
• Incubaties worden in een vochtige 37 ° C en 5% CO ₂ incubator.
• Alle media en reagentia zijn voorafgaand gefilterd om te gebruiken in een 0,2 um filter, bewaard bij 4 ° C, en voorverwarmd bij 37 ° C voor gebruik.
• Tijdens de dissectie stappen, moeten alle embryo's en weefsels worden bewaard op ijs.
• Alle reagens kolven worden ontsmet met ethanol voor plaatsing in een kast.
• Gebruik van handschoenen, laboratoriumjas, en verpleegkundige caps zijn verplicht.

Conclusie

We hebben een video die laat zien hoe te isoleren, afleiden, en de cultuur embryonale kiemcellen van gonadale bergkammen van 10,5-11,5 DPC muizenembryo's. De reproduceerbare isolatie en de lange termijn de cultuur van embryonale germinal cellijnen levert een essentiële grondslag voor de studie van de vroege embryonale ontwikkeling, genetische en epigenetische Germinal patronen, gonaden vorming, milieu-effecten van omliggende organen tijdens het ontwikkelingsproces van gametogenese in de mannelijke en vrouwelijke embryo's, en de bepaling van paden dat leidt tot kanker en onvruchtbaarheid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10.5 - 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse.
Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC		SCRC-1040
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Invitrogen	14190/086
Collagenase /Dispase Solution	Roche Group	269638
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M4287
Trypsin EDTA	Invitrogen	25200-072
MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose	Invitrogen	10566024
10% Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000/044
1% of antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096
Knockout Media: 80% knockout D-MEM	Invitrogen	10829/018
20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen		25130/081	with β-mercapt–thanol Sigma Catalogue Number: M7522
1X non essential amino acid solution	Invitrogen	11140/050
1% antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096	supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106
40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech		250-03
20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF)	Invitrogen	13256-029
Corning center well culture dish 60mm	Fisher Scientific	07-200-79	1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes
Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes. Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.