בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז'רמינל

Summary

היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.

Abstract

היכולת של תאים עובריים נבטי (למשל) כדי להתמיין לתאי נבטי קדמוני (PGCs) ומאוחר יותר לתוך הגמטות במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 בימים שלאחר coitum (DPC) עוברי עכברים. פיתוח רכסים האשכים מעוברים העכבר (C57BL6J) היו מנותקים על ידי הפרעה מכנית עם collagenase, אז מצופה שכבה העובר עכבר מזין פיברובלסטים (MEF-CF1) כי היה בעבר מומת mitotically בנוכחות התקשורת בנוקאאוט עם mitomycin C שיושלם עם מעכבי לוקמיה פקטור (LIF), פיברובלסטים בסיסי גורם הגדילה (bFGF), וכן גורם לתאי גזע (SCF). שימוש בשיטות אלה אופטימיזציה עבור זיהוי ובידוד PCG, והקמת התנאים תרבות היתרי תרבויות ארוך טווח של תאים EG במשך יותר מ 40 ימים. הקווים עובריים נבטי הראו פנוטיפ הביטוי עובריים של סמנים בשימוש משותף של המדינה pluripotent. בידוד הגזירה של תאים נבטי בתרבות לספק כלי להבין את התפתחותם במבחנה מציעים את ההזדמנות כדי לפקח על נזק מצטבר ברמות גנטיים epigenetic לאחר חשיפה סטרס חמצוני.

Protocol

חלק 1: laparotomy עכבר בהריון

1. שימוש נקע בצוואר הרחם, להרדים עכבר בהריון C57BL6J נקבה ב 10.5-11.5 DPC.
2. נקו את הבטן עם סבון מיקרוביאלית, ולאחר מכן, לגלח אותו.
3. לאחר גילוח, לשטוף את הבטן עם מלוחים פתרון.
4. לאחר מכן, לייבש את הבטן עם גזה סטרילית.
5. מכסים את העכבר עם שדה סטרילית חדשה.
6. ביצוע חתך הגחון באמצעות מלקחיים ומספריים לנתיחה.
7. לזהות ולהסיר את הרחם כולו מתוך חלל הבטן. עוברי עכבר יוצג בתוך הרחם.
8. מעבירים את הרחם לתוך צלחת פטרי מלא D-PBS, ולשמור על הקרח.
9. באמצעות אזמל סטרילי מלקחיים, להסיר את השלייה ורקמות נוספות העוברית של העובר כל אחד.
10. העברת עוברים לתוך צלחת פטרי טרי מלא D-PBS.
11. מדוד את אורך של עוברי עכברים. מצאנו כי בגדלים שונים בהתאם לגיל העובר. לדוגמה 8.5 DPC נמדד בקצב ממוצע של 6 מ"מ, נמדד 10.5 DPC בקצב ממוצע של 11mm, ו - 12.5 DPC נמדד ממוצע של 16 מ"מ.
12. לאחר מכן, להסיר את זנבותיהם להפקת DNA.

חלק 2: Dissection רידג' האשכים

תחת stereomicroscope ואת מקור אור שוט Fostec

1. מניחים נייר סינון בצלחת פטרי. ואז, במקום העובר העכבר על גבי נייר הסינון לייבש את העובר ואת לשתק לנתיחה.
2. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך רוחבי של העובר העכבר מעל המקור של חבל הטבור.
3. תחת stereomicroscope, באמצעות מלקחיים בסדר סטרילי מחט סטרילית מתגרה בסדר, להסיר את המעיים והכבד כל כך את מערכת השתן גלוי.
   הכליות ממוקמות רוחבית בחלל הבטן, ואת שלפוחית ​​השתן ממוקמת המדיאלי ואת הזנב בהשוואה הכליות. העובר יכול להיות מזוהה כזכר כי רכסי האשכים נמצאים משני צדי השלפוחית. אצל האשה, הרכסים האשכים מחוברים בחוזקה עד הסוף לרוחב הזנב של הכליות.
4. קולפים את רכס האשכים על ידי הזזה מחט מאחורי זה. רכס האשכים מוסר על ידי חיתוך משם הרקמות התומכות בה.
5. העברת רכסי האשכים כדי בצלחת פטרי חדש מלא טרי D-PBS.
   מיקרוסקופית, רכס האשכים הגברי צריך להיות חשוף, גדולים בצורת אליפסה. לעומת זאת, רכס האשכים הנשי צריך להיות הבחינו, יש צורה מאורכת ולהיות קטן ביחס הרכס האשכים הגברי.

חלק 3: עיכול רידג' האשכים

תחת stereomicroscope:

1. Dissection כלית בינים: אשך נפרדת מן כלית בינים לבין רכס באמצעות מחט דק וחד.
   • חשוב להסיר את כלית בינים מן הרכס האשכים כי זה רקמות סומטיות כי יהיה לגדול יותר בתהליך הגזירה PGC.
2. עיכול רידג' האשכים: איסוף רכסים האשכים נקי ירידה 0.5ul של טרי D-PBS. הוסף 20 מ"ל של פתרון collagenase / Dispase (ריכוז סופי ב 1mg/ml).
   • עוברים צריך להיות מעובד בנפרד. כל העובר צריך לבד נפרד שכותרתו שלה צלחת פטרי.
3. האשכים רידג' ממינסינג: חותכים את רכס האשכים לחתיכות קטנות באמצעות מחט סטרילית מלקחיים בסדר סטרילי מס '4.
4. דגירה: צלחות פטרי מועברים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
   • זמן הדגירה יכול להשתנות בין רקמות.
5. Pipetting: לאחר 15 דקות, הרקמה יכולה להיות מנותקת על ידי pipetting. שימוש pipettes משך נימי זכוכית בקטרים ​​בין 40 -100 מ"מ לשבור את השברים על ידי pipetting למעלה ולמטה. זה יהיה בצורת גושים קטנים. העברת גושי כדי 0.5ml של ירידה מראש D-PBS חימם עבור לשטוף סופית.
6. לאחר כביסה, העברת גושי לצינורות Eppendorf.
   • אל מעל לחשוף את רקמות collagenase.
   • אל תעשו ההשעיה תא בודד. זה חשוב להקמת המושבה. אם זו השעיה תא בודד, PGCs נוטים לבדל ולנדוד.
   • תהליך זה לא צריך להיות יותר מ 20 דקות, או תאים שלך תאבד את הכדאיות.
7. צנטריפוגה בסל"ד 2000 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
8. לאחר centrifuging, להסיר את supernatant ו resuspend את הכדור בתוך 0.5 מ"ל של לדפוק את שיושלם מדיה (Pre-התחמם ב 37 מעלות צלזיוס).

חלק 4: התרבות תאים שן ז'רמינל

"אתה צריך לבצע את הצעדים הבאים מהר כדי לשמר את הכדאיות של PGCs עבור בידוד הגזירה.

1. 24 שעות לפני התהליך הזה אתה צריך להכין מומת mitotically-MEF CF1 מזין שכבת בעקבות פרוטוקול מ ג'אנג ג'יי et al 2008.
   • הכינו 20 מנות עבור pregna onent נקבה העכבר (6-8 עוברים).
   • MEFs מאבדים את היכולת להיות שכבה מזין (לקדם את הצמיחה ולמנוע בידול) אחרי 5-6 קטעים.
   • אין להשתמש MEFs יותר מ -48 שעות.
2. מיד לפני PGCs ציפוי, המדיום MEF יש להסיר לאט מהשכבה מזין MEF.
3. לאחר מכן, להוסיף 0.5 מ"ל / היטב מראש חימם בינוני בנוקאאוט שיושלם על שכבת מזין MEF.
   • MEF התקשורת מכיל בסרום שור העובר כי גורם הבידול של PGCs.
   • בינוני נוק יש להשלים עם גורמי גדילה ספציפיים מצלצלים מיד לפני השימוש, כדי להבטיח את פעילותו של הגורם לגדול.
4. באמצעות הפצה סימטרי, PGCs צלחת מעל שכבת מזין MEF.
   • אם החלקים האלה הם קרובים מדי, הם נוטים לצבור ולעשות במושבות צפופות לצרף גרוע או להתחיל מבדל.
   • מנות התרבות חייבת להיות תווית עם שם עובריים קו ז'רמינל התא, מספר קטע, ותאריך.
5. בזהירות, להעביר את הכלים לתוך תרבות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO _2.
6. צג התאים כל 24 שעות.
7. לאחר 48 שעות, להסיר 250 מ"ל של מדיה העליון של התרבות להימנע מטריד מצורף של המושבה. ואז, להוסיף 250 מ"ל של טרי עקום החוצה התקשורת השלים (מחומם מראש על 37 ° C).
8. אחרי שלב 7, לחכות עוד 48 שעות, ולאחר מכן, להסיר לחלוטין את כל התקשורת ולהחליפו בתוספת התקשורת עקום החוצה טרי (מחומם מראש על 37 ° C). האם זה כל 2 ימים 8-10 ימים עד ליצור מושבות PGC.

חלק 5: תאים עובריים ז'רמינל

1. לאחר 10 ימים של בידוד PGC, מושבות תאים עובריים נבטי נוצרים.
2. שורות תאים עובריים נבטי נשמרים חי על ידי קטעים ידנית כל 8-10 ימים. הם ממשיכים להוות מורפולוגיה מובחן ולהביע סמנים pluripotency כגון alkalyne phosphatase, אוקטובר-4, SSEA-1, ו - SOX-2

הערות

• בתנאים סטריליים / aseptic חיוניים בחדר התרבות.
• עבור הגזירה ותרבות, PGCs מעובדים ממשלה מחלקה מטהר ביו בטיחות השנייה.
• Incubations נמצאים humidified 37 ° C ו 5% CO ₂ באינקובטור.
• כל התקשורת ואת ריאגנטים מסוננים לפני השימוש במסנן 0.2 אממ, המאוחסן ב 4 ° C, מראש התחמם ב 37 מעלות לפני השימוש.
• במהלך השלבים לנתיחה, עוברים כל ורקמות חייב להישמר על הקרח.
• צלוחיות כל מגיב הם לחטא עם אתנול לפני הצבת בארון.
• שימוש בכפפות, חלוק, וכובעים אחות הם חובה.

מסקנה

סיפקנו וידאו המראה כיצד לבודד, להפיק, ואת התרבות תאים עובריים נבטי מ רכסים האשכים של 10.5-11.5 עוברים DPC העכבר. הבידוד לשחזור התרבות לטווח ארוך של שורות תאים עובריים נבטי מספק בסיס חיוני למחקר של ההתפתחות העוברית המוקדמת, נבטי דפוסים גנטיים epigenetic, היווצרות בלוטת המין, ההשפעות הסביבתיות של האיברים הסמוכים במהלך תהליך התפתחותי של gametogenesis של עוברי זכר ונקבה, וקביעת מסלולים שמוביל לסרטן פוריות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10.5 - 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse.
Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC		SCRC-1040
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Invitrogen	14190/086
Collagenase /Dispase Solution	Roche Group	269638
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M4287
Trypsin EDTA	Invitrogen	25200-072
MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose	Invitrogen	10566024
10% Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000/044
1% of antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096
Knockout Media: 80% knockout D-MEM	Invitrogen	10829/018
20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen		25130/081	with β-mercapt–thanol Sigma Catalogue Number: M7522
1X non essential amino acid solution	Invitrogen	11140/050
1% antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096	supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106
40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech		250-03
20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF)	Invitrogen	13256-029
Corning center well culture dish 60mm	Fisher Scientific	07-200-79	1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes
Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes. Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.