Summary
भ्रूण कीटाणु कोशिकाओं के प्रारंभिक विकास चरणों के दौरान मौलिक कीटाणु कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के लिए एक आदर्श कैंसर और बांझपन के बारे में हमारी परिकल्पना पता मॉडल है. इस प्रोटोकॉल पता चलता है कि कैसे 10.5-11.5 दिनों के बाद coitum माउस भ्रूण में विकासशील gonads से मौलिक कीटाणु कोशिकाओं को अलग करने के लिए.
Abstract
भ्रूण कीटाणु कोशिकाओं की क्षमता (जैसे) के प्रारंभिक विकास चरणों के दौरान मौलिक कीटाणु कोशिकाओं (PGCs) में और बाद में gametes में अंतर करने के लिए एक आदर्श कैंसर और बांझपन के बारे में हमारी परिकल्पना पता मॉडल है. इस प्रोटोकॉल पता चलता है कि कैसे 10.5-11.5 दिनों के बाद coitum (डीपीसी) माउस भ्रूण में विकासशील gonads से मौलिक कीटाणु कोशिकाओं को अलग करने के लिए. माउस भ्रूण से gonadal लकीरें का विकास (C57BL6J) collagenase के साथ यांत्रिक विघटन, तो एक माउस भ्रूण fibroblast फीडर (MEF - CF1) परत है कि पहले mitotically mitomycin सी के साथ पीटा मीडिया की उपस्थिति में निष्क्रिय और लेकिमिया अवरोध करनेवाला के साथ पूरक में चढ़ाया द्वारा अलग थे (LIF) फैक्टर, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF), और स्टेम सेल फैक्टर (SCF). PCG पहचान, अलगाव, संस्कृति शर्तों के और स्थापना के लिए इन अनुकूलित विधियों का प्रयोग अधिक से अधिक 40 दिनों के लिए ईजी कोशिकाओं के दीर्घकालिक संस्कृतियों परमिट. भ्रूण कीटाणु सेल लाइनों भ्रूण और pluripotent राज्य के आम उपयोग मार्करों के phenotype अभिव्यक्ति दिखाया. अलगाव और संस्कृति में कीटाणु कोशिकाओं की व्युत्पत्ति एक उपकरण के लिए इन विट्रो में उनके विकास को समझने और आनुवंशिक और epigenetic स्तर पर oxidative तनाव के प्रदर्शन के बाद संचयी नुकसान की निगरानी करने का अवसर प्रदान करते हैं प्रदान करते हैं.
Protocol
भाग 1: गर्भवती माउस laparotomy
- ग्रीवा अव्यवस्था का प्रयोग, 10.5-11.5 डीपीसी में एक गर्भवती महिला माउस C57BL6J euthanize.
- रोगाणुरोधी साबुन के साथ पेट को साफ करें, और तब, यह दाढ़ी.
- हजामत बनाने के बाद, एक नमकीन घोल के साथ पेट धोने.
- फिर, एक बाँझ धुंध के साथ पेट की सूखी.
- एक नए बाँझ क्षेत्र के साथ माउस को कवर.
- एक उदर संदंश और विच्छेदन कैंची का उपयोग चीरा बनाओ.
- पहचानें और उदर गुहा से पूरे गर्भाशय निकालना. माउस भ्रूण गर्भाशय के अंदर दिखाई जाएगी.
- डी पीबीएस के साथ भरा एक पेट्री डिश में गर्भाशय स्थानांतरण, और बर्फ पर रख.
- एक बाँझ स्केलपेल और संदंश का प्रयोग, नाल और प्रत्येक भ्रूण के अतिरिक्त भ्रूण के ऊतकों को हटा दें.
- एक ताजा पेट्री डी पीबीएस के साथ भरा पकवान में भ्रूण स्थानांतरण.
- माउस भ्रूण की लंबाई उपाय. हमने पाया है कि आकार भ्रूण उम्र के अनुसार भिन्न. डीपीसी 6mm के एक औसत मापा 8.5 उदाहरण के लिए, 10.5 डीपीसी 11mm के एक औसत मापा, और 12.5 डीपीसी 16 मिमी की एक औसत पर मापा.
- फिर, डीएनए निष्कर्षण के लिए अपनी पूंछ हटा दें.
भाग 2: gonadal कटक विच्छेदन
Stereomicroscope और हल्की स्रोत Schott Fostec के तहत
- एक पेट्री डिश में एक फिल्टर पेपर रखें. फिर, फिल्टर पेपर के शीर्ष पर माउस भ्रूण जगह भ्रूण शुष्क और विच्छेदन के लिए स्थिर है.
- एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, गर्भनाल के मूल के ऊपर एक माउस भ्रूण की अनुप्रस्थ काट कर.
- Stereomicroscope के तहत, बाँझ ठीक संदंश और एक बाँझ ठीक चिढ़ा सुई का उपयोग कर, आंतों और जिगर इतना दूर है कि मूत्र प्रणाली दिखाई देता है.
गुर्दे पार्श्व उदर गुहा में स्थित हैं, और औसत दर्जे का है और दुम मूत्राशय गुर्दे की तुलना में स्थित है. भ्रूण पुरुष के रूप में पहचाना जा सकता है क्योंकि gonadal लकीरें मूत्राशय के दोनों तरफ स्थित हैं. महिला, gonadal लकीरें मजबूती से गुर्दे की दुम का पार्श्व अंत से जुड़ी हैं. - इसके पीछे एक सुई फिसलने द्वारा gonadal रिज बाहर छील. gonadal रिज दूर ऊतकों है कि यह समर्थन काटने से निकाल दिया जाता है.
- एक नया पेट्री ताजा डी - पीबीएस से भरा पकवान gonadal लकीरें स्थानांतरण.
Microscopically, पुरुष gonadal रिज छीन लिया हो, बड़े और अंडाकार आकार में होना चाहिए. इसके विपरीत, महिला gonadal रिज देखा जाना चाहिए, लम्बी आकार और पुरुष gonadal रिज की तुलना में छोटा होना.
भाग 3: gonadal कटक पाचन
के तहत stereomicroscope:
- Mesonephros विच्छेदन: mesonephros और रिज एक ठीक है और तेज सुई का उपयोग कर से अलग जननपिंड.
- यह महत्वपूर्ण है gonadal रिज से mesonephros दूर क्योंकि यह एक दैहिक ऊतक कि PGC व्युत्पत्ति प्रक्रिया में अधिक बढ़ना होगा.
- Gonadal कटक पाचन: ताजा डी - पीबीएस के 0.5ul ड्रॉप में साफ gonadal लकीरें लीजिए. Collagenase / Dispase समाधान के 20 मिलीलीटर (1mg/ml पर अंतिम एकाग्रता) जोड़ें.
- भ्रूण व्यक्तिगत रूप से संसाधित किया जाना चाहिए है. प्रत्येक भ्रूण की अपनी अलग और लेबल पेट्री डिश चाहिए.
- कटक नख़रेबाज़ gonadal: छोटे - छोटे टुकड़ों में gonadal रिज एक बाँझ सुई और बाँझ ठीक संदंश नंबर 4 का उपयोग कर काटो.
- ऊष्मायन: पेट्री डिश 37 पर एक मशीन को हस्तांतरित कर रहे हैं ° सी 15 मिनट के लिए.
- ऊष्मायन समय ऊतकों के बीच भिन्न हो सकता है.
- Pipetting: 15 मिनट के बाद, ऊतक pipetting द्वारा अलग हो सकता है. 40 -100 मिमी के बीच diameters के साथ खींच गिलास केशिका pipettes का उपयोग ऊपर और नीचे pipetting द्वारा टुकड़े तोड़. इस छोटे से फार्म clumps जाएगा. 0.5ml एक पूर्व अंतिम धोने के लिए गर्म ड्रॉप डी पीबीएस clumps स्थानांतरण.
- धोने के बाद, Eppendorf ट्यूबों clumps हस्तांतरण.
- ऊतक collagenase पर बेनकाब नहीं करो.
- एक एकल कक्ष निलंबन मत बनाओ. इस कॉलोनी के गठन के लिए महत्वपूर्ण है. अगर यह एक एकल कक्ष निलंबन, PGCs अंतर और विस्थापित करते हैं.
- यह प्रक्रिया 20 मिनट से अधिक नहीं हो, या अपने कोशिकाओं व्यवहार्यता खो देंगे चाहिए.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- Centrifuging के बाद, सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, और पूरक मीडिया बाहर दस्तक (37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व - गर्म) के 0.5 मिलीलीटर में गोली resuspend.
भाग 4: मौलिक कीटाणु कक्ष संस्कृति
"आप अगले कदम जल्दी से प्रदर्शन करने के लिए अलगाव और व्युत्पत्ति के लिए PGCs की व्यवहार्यता की रक्षा करना चाहिए.
- इस प्रक्रिया से पहले 24 घंटे आप एक mitotically निष्क्रिय MEF - CF1 फीडर जांग जे एट अल 2008 से प्रोटोकॉल के बाद परत तैयार करना चाहिए.
- एक pregna के लिए 20 व्यंजन तैयारNT के महिला माउस (6-8 भ्रूण).
- MEFs एक फीडर परत (5-6 मार्ग के बाद विकास को बढ़ावा देने और भेदभाव को रोकने) करने की क्षमता खो देते हैं.
- 48 घंटे से अधिक उम्र के MEFs का उपयोग न करें.
- तुरंत चढ़ाना PGCs पहले MEF मध्यम धीरे MEF फीडर परत से हटा दिया जाना चाहिए.
- फिर, 0.5 / अच्छी तरह से पूर्व गर्म पूरक MEF फीडर परत पर पीटा मध्यम मिलीलीटर जोड़ें.
- MEF मीडिया भ्रूण गोजातीय सीरम है कि PGCs के भेदभाव लाती हैं.
- नॉकआउट मध्यम नकदी विशिष्ट विकास कारकों के साथ पूरक होना चाहिए तुरंत पहले बढ़ने कारक की गतिविधि को सुनिश्चित करने के लिए उपयोग.
- सममित, MEF फीडर परत से अधिक वितरण थाली PGCs का उपयोग करना.
- यदि इन टुकड़ों को भी बंद कर रहे हैं, वे कुल के लिए करते हैं और घने कालोनियों कि खराब देते हैं या फर्क शुरू कर.
- संस्कृति व्यंजन कीटाणु भ्रूण सेल लाइन का नाम, बीतने संख्या, और दिनांक के साथ लेबल किया जाना चाहिए.
- ध्यान से, एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर संस्कृति बर्तन हस्तांतरण.
- कोशिकाओं को हर 24 घंटे मॉनिटर.
- 48 घंटे के बाद, संस्कृति के बहुत ऊपर से मीडिया के 250 मिलीलीटर हटायें कॉलोनी लगाव को परेशान करने से बचने के लिए. फिर, ताजा पूरक दस्तक बाहर मीडिया के 250 मिलीलीटर (37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व - गरम) जोड़ें.
- 7 कदम के बाद, एक और 48 घंटे प्रतीक्षा करें, और फिर, पूरी तरह से सभी मीडिया हटाने और यह ताजा बाहर दस्तक पूरक मीडिया (37 ° C पर पूर्व - गर्म) के साथ बदलें. PGC कालोनियों फार्म जब तक 8-10 दिनों के लिए यह हर 2 दिन मत करो.
भाग 5: भ्रूण कीटाणु कक्ष
- PGC अलगाव के 10 दिनों के बाद, भ्रूण कीटाणु सेल कालोनियों का गठन कर रहे हैं.
- भ्रूण कीटाणु सेल लाइनों मैनुअल हर 8-10 दिनों मार्ग द्वारा जीवित रखा जाता है. वे एक undifferentiated आकारिकी वर्तमान और alkalyne फॉस्फेट, Oct-4, SSEA-1, और SOX-2 के रूप में pluripotency मार्करों व्यक्त जारी
नोट्स
- बाँझ / सड़न रोकनेवाला शर्तों संस्कृति कमरे में आवश्यक हैं.
- व्युत्पत्ति और संस्कृति के लिए, PGCs शोधक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा मंत्रिमंडल में संसाधित कर रहे हैं.
- Incubations humidified 37 में डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर.
- सभी मीडिया और अभिकर्मकों फ़िल्टर्ड रहे हैं पहले एक 0.2 उम फिल्टर, 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस में उपयोग करने के लिए, और 37 डिग्री सेल्सियस पूर्व गरम उपयोग करने से पहले.
- विच्छेदन चरणों के दौरान सभी भ्रूण ऊतकों और बर्फ पर रखा जाना चाहिए.
- सभी अभिकर्मक बोतल इथेनॉल के साथ एक कैबिनेट में रखने से पहले decontaminated हैं.
- दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, और नर्स टोपी का प्रयोग अनिवार्य हैं.
निष्कर्ष
हम एक वीडियो है कि आप से पता चलता है कि किस तरह अलग करने के लिए निकाले जाते हैं, और संस्कृति 10.5-11.5 डीपीसी माउस भ्रूण के gonadal लकीरें से भ्रूण कीटाणु कोशिकाओं प्रदान की है. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और भ्रूणीय कीटाणु कोशिका लाइनों के दीर्घकालिक संस्कृति अलगाव जल्दी भ्रूण के विकास, आनुवंशिक और epigenetic कीटाणु पैटर्न, जननपिंड गठन के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण आधार प्रदान करता है, नर और मादा भ्रूण में gametogenesis के विकास की प्रक्रिया के दौरान आसपास के अंगों के पर्यावरणीय प्रभाव, और रास्ते का निर्धारण है कि कैंसर और बांझपन की ओर जाता है.
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Disclosures
मिसिसिपी राज्य विश्वविद्यालय में: इस अनुसंधान की समीक्षा करने और संस्थागत पशु की देखभाल और हमारे माउस प्रोटोकॉल # ०८,०३० (होल्डिंग और प्रजनन प्रोटोकॉल प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन रोगाणु लाइन के विकास और ट्यूमर गठन में प्रजाति - ROS की भूमिका) का प्रयोग करें समिति के अनुमोदन (IACUC) के बाद आयोजित किया गया.
Acknowledgments
, डॉ. लुसी Senter, डा. ब्रिजिट Willeford और MSU ALAC मान्यता प्राप्त माउस सुविधा प्रशिक्षण और जानवरों की देखभाल के साथ सहायता के लिए माइक Basett, डॉ. ड्वेन समझदार डॉ. नील पहले और पांडुलिपि संपादन के लिए Kourtney विल्किनसन: लेखकों के अमूल्य मदद स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं Cesar Monroy, हन्ना Swoope, और MSU में वीडियो उत्पादन के साथ उनकी सहायता के लिए Bobbie हडलस्टन, माइक्रोस्कोपी और छवि पर कब्जा के साथ उसकी सहायता के लिए. इस शोध संस्थागत अनुसंधान और मिसिसिपी राज्य विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान विभाग के कार्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10.5 - 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | |||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | |
| Collagenase /Dispase Solution | Roche Group | 269638 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Mitomycin C | Sigma-Aldrich | M4287 | |
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | |
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | |
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | |
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | |
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercapt–thanol Sigma Catalogue Number: M7522 | |
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | |
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | ||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | |
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher Scientific | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
| Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes. Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. |
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Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. |
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Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. |
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| Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. | |||
References
- DeFelici, M. Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, Second Edition, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
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