Summary
초기 개발 단계 동안 원시 종자 세포로 차별화하는 배아 새싹 세포의 능력은 암, 불임에 관한 우리의 가설을 해결하기 위해 완벽한 모델입니다. 이 프로토콜은 10.5-11.5 일 게시 coitum 마우스 배아의 개발 생식선에서 원시 종자 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
배아 새싹 세포의 기능 (예) 암, 불임에 관한 우리의 가설을 해결하기 위해 완벽한 모델입니다 초기 발달 단계 동안 원시 종자 세포 (PGCs)로 나중에 gametes로 구별합니다. 이 프로토콜은 10.5-11.5 일 게시물 coitum (DPC) 마우스 배아의 개발 생식선에서 원시 종자 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 마우스 배아에서 gonadal 능선을 개발 (C57BL6J) 다음 이전 mitotically 녹아웃 미디어의 존재에있는 mitomycin C와 inactivated과 백혈병 억제제로 보충되었다 마우스 배아 fibroblast 공급기 층 (MEF - CF1)에 도금 collagenase와 기계 파괴에 의해 dissociated되었습니다 팩터 (난생), 기본 Fibroblast의 성장 인자 (bFGF), 그리고 줄기 세포 계수 (SCF). 문화 조건 PCG 식별, 격리 및 설립을위한 이러한 최적화 방법을 사용하면 40 개 이상의 일간 EG 세포의 장기적인 문화를 수 있습니다. 태아의 새싹 세포 라인은 pluripotent 국가의 일반적인 사용 마커의 배아 표현형과 표현을 보여주었다. 분리 및 문화에 새싹 세포의 유도는 체외에서 개발을 이해하고 산화 스트레스에 노출 후 유전 및 epigenetic 수준에서 누적 손상을 모니터링하는 기회를 제공하는 도구를 제공합니다.
Protocol
1 부 : 임산부 마우스 개복술
- 자궁 경부 전위를 사용하여, 10.5-11.5 DPC에서 임신 여성 C57BL6J 마우스를 안락사.
- 다음 항균 비누로 복부를 청소하고, 그것을 면도.
- 면도 후, 생리 식염수로 복부를 씻으십시오.
- 그리고, 멸균 거즈로 복부를 건조.
- 새로운 멸균 분야로 마우스를 커버.
- 포셉 및 해부 가위를 사용하여 복부 절개를합니다.
- 식별 및 복강에서 전체 자궁을 제거합니다. 마우스 배아는 자궁 안에 표시됩니다.
- D - PBS로 가득 배양 접시에 자궁을 전송하고, 얼음에 보관하십시오.
- 살균 메스와 집게를 사용하여 태반 및 각 배아의 여분의 배아 조직을 제거합니다.
- D - PBS로 가득 신선한 페트리 접시에 배아를 전송합니다.
- 마우스 배아의 길이를 측정합니다. 우리는 크기가 배아의 연령에 따라 다릅니다 것으로 나타났습니다. 예를 들어 8.5 DPC는 6mm의 평균 측정, 10.5 DPC는 11mm의 평균에서 측정하고, 12.5 DPC는 16 mm의 평균 측정.
- 그런 다음, DNA 추출을 위해 자신의 꼬리를 제거합니다.
2 부 : Gonadal 리지 해부
stereomicroscope 및 광원 쇼트 Fostec 아래
- 페트리 접시에 여과지를 놓습니다. 그런 다음, 배아를 건조하고 해부에 대한 고정하기 위해 필터 종이 위에 마우스 배아를 놓습니다.
- 멸균 메스를 사용하여 탯줄의 기원 위에 마우스 배아의 가로 절단합니다.
- stereomicroscope에서 살균 고급 포셉 및 살균 고급 괴롭히고 바늘을 사용하여 비뇨기 시스템이 볼 수 있도록 창자와 간장을 제거하십시오.
신장은 복강에 옆으로 위치하고 있으며, 방광은 신장에 비해 중간과 꼬리에 위치하고 있습니다. gonadal 산등성이가 방광의 양쪽에 위치하고 있기 때문에 배아는 남자로 확인할 수 있습니다. 여성에 gonadal 산등성이는 단단히 신장의 꼬리 끝에 측면에 붙어있다. - 그 뒤에 바늘을 슬라이딩하여 gonadal 리지 밖으로 껍질. gonadal 봉우리는 그것을 지원하는 조직을 떠나 절단하여 제거됩니다.
- 신선한 D - PBS로 가득한 새로운 배양 접시에 gonadal 능선을 전송합니다.
미세, 남성 gonadal 능선은 크고 모양 타원형 송두리째해야합니다. 반면, 여성 gonadal 능선을 발견해야 길쭉한 모양을하고 남성 gonadal 능선에 비해 작은 수 있습니다.
파트 3 : Gonadal 리지 소화
아래 stereomicroscope :
- Mesonephros의 해부 : 좋은과 날카로운 바늘을 사용하여 mesonephros과 능선에서 분리 생식선.
- 그것은 PGC의 유도 과정에서 자라다하는 체세포 조직이기 때문에 gonadal 산등성이에서 mesonephros을 제거하는 것이 중요합니다.
- Gonadal 리지 소화 : 신선한 D - PBS의 0.5ul 드롭 깨끗한 gonadal 산등성이를 수집합니다. Collagenase / Dispase 솔루션 20 ML (1mg/ml 최종 농도)를 추가합니다.
- 배아는 개별적으로 처리되어야합니다. 각각의 배아 자체 별도의 표시 페트리 접시가 있어야합니다.
- 리지가 민싱 Gonadal : 살균 멸균 바늘과 좋은 포셉 제 4를 사용하여 작은 조각으로 gonadal 리지 컷.
- 배양 : 배양 접시가 37 인큐베이터으로 전송됩니다 ° C 15 분.
- 배양 시간은 조직간에 다를 수 있습니다.
- Pipetting : 15 분 후, 조직 pipetting하여 dissociated 수 있습니다. 40 -100 mm 사이의 직경과 함께 뽑아 유리 모세관 pipettes를 사용하면하고 아래로 pipetting하여 작품을 브레이크. 이것은 작은 대단히 짧은 시간을 형성합니다. 최종 세척을 위해 미리 예열 D - PBS 드롭의 0.5ml에 대단히 짧은 시간을 전송합니다.
- 세척 후, eppendorf 튜브에 대단히 짧은 시간을 전송하기만하면됩니다.
- 이상 collagenase로 조직을 노출시키지 마십시오.
- 단일 세포 현탁액을하지 마십시오. 이것은 식민지 형성에 중요합니다. 그것이 하나의 세포 현탁액 경우, PGCs는 차별과 마이 그 레이션하는 경향이 있습니다.
- 이 과정은 20 분 이상하지 않아야, 또는 세포 생존을 잃게됩니다.
- 실온에서 5 분간 2000 rpm으로 원심 분리기.
- centrifuging 후, 뜨는을 제거하고, 미디어 밖으로 보충 노크 (37 ° C에서 미리 예열)의 0.5 ML의 펠렛을 resuspend.
4 부 : 원시 종자 세포 문화
"당신은 격리와 유도를위한 PGCs의 생존을 유지하기 위해 신속하게 다음 단계를 수행합니다.
- 24시간이 과정을하기 전에 장 J. 외 2008 프로토콜에 따라 mitotically inactivated MEF - CF1 피더 레이어를 준비한다.
- 한 pregna 20 요리를 준비NT 여성 마우스 (6-8 배아).
- MEFs은 5-6 구절 후 (성장을 도모하고 차별을 방지) 피더 레이어 수있는 능력을 잃게됩니다.
- 48시간보다 오래된 MEFs를 사용하지 마십시오.
- 즉시 도금 PGCs 전에 MEF 매체는 서서히 MEF 피더 레이어에서 제거되어야합니다.
- 그렇다면, 0.5 ML / 음의 MEF 피더 계층에 미리 예열 보충 녹아웃 매체를 추가합니다.
- MEF 미디어 PGCs의 차별을 유도 태아 소 혈청이 포함되어 있습니다.
- 마네 매체가 정화 특정 성장 요인과 함께 보충해야하는 것은 바로 전에 성장 인자의 활동을 보장하기 위해 사용합니다.
- MEF 피더 층 이상의 대칭 유통, 판 PGCs을 사용합니다.
- 이 조각이 너무 가까이있다면, 그들은 집계하는 경향과 저조한 첨부하거나 차별 시작 밀도 식민지합니다.
- 문화 요리는 배아 본원 세포주 이름, 통로 번호 및 날짜와 함께 표시해야합니다.
- 신중하게, 37 ° C와 5% CO 2 배양기에 문화 요리를 전송할 수 있습니다.
- 세포마다 24 시간 모니터링합니다.
- 48 시간 후, 식민지의 첨부 파일을 방해하지 않도록하기 위해 문화의 맨에서 미디어 250 ML를 제거합니다. 그런 다음, 신선한 보충 노크 아웃 미디어 250 ML (37 ° C에서 미리 예열)을 추가합니다.
- 7 단계 후, 또 다른 48 시간을 기다린 후, 완전히 모든 미디어를 제거하고 신선한 노크 아웃 보충 미디어 (37 ° C에서 미리 예열)로 바꾸십시오. PGC 식민지 양식까지 80~10일이 이일 모든 마십시오.
제 5 부 : 본원 배아 세포
- PGC 절연 10 일 후, 본원 배아 세포 식민지가 형성됩니다.
- 태아의 새싹 세포 라인 수동 구절마다 80-10일에 의해 생명을 유지하고 있습니다. 그들은 undifferentiated 형태를 제시하고 같은 alkalyne 인산 가수 분해 효소, 10 - 4, SSEA - 1, 및 SOX - 2로 pluripotency 마커를 표현하기 위해 계속
노트
- 멸균 / 무균 조건은 문화 실에 필수적입니다.
- 파생 문화, PGCs는 정수기 클래스 II 바이오 안전 내각에 처리됩니다.
- Incubations가 humidified 37 아르 ° C와 5% CO 2 배양기.
- 모든 미디어 및 시약 4에 저장된 음 0.2 필터 ° C에서 사용하기 전에 필터링하고, 사용하기 전에 ° C 37 미리 예열하고 있습니다.
- 해부 단계 동안, 모든 배아와 조직은 얼음에 보관해야합니다.
- 모든 시약의 flasks는 캐비닛에 배치하기 전에 에탄올로 소독하고 있습니다.
- 장갑, 연구실 코트, 그리고 간호사 모자의 사용은 필수입니다.
결론
우리는 당신이 분리하는 방법을 보여줍니다 비디오, 파생 및 10.5-11.5 DPC 마우스 배아의 gonadal 산등성이에서 문화 배아 새싹 세포를 제공하고 있습니다. 배아 새싹 세포 라인의 재현성 분리 및 장기 문화가 초기 배아 발달, 유전 및 epigenetic 본원 패턴, 생식선 형성의 연구를위한 중요한 기반을 제공, 남자와 여자 태아에 gametogenesis의 발달 과정에서 주변 장기의 환경적 영향, 그리고 암, 불임로 연결 통로의 결정.
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Disclosures
미시시피 주립 대학에서이 연구 검토 및 기관 애니멀 케어 및 마우스 프로토콜 # 08030 (프로토콜을 개최하고 사육 반응 산소 세균 라인 개발 및 종양 형성에 종 - ROS의 역할)의 이용위원회 (IACUC) 승인 후 실시했다.
Acknowledgments
; 박사 루시 센터, 닥터 Brigit Willeford 및 MSU ALAC 공인 마우스 시설에서 교육 및 동물 관리와 지원을위한 마이크 Basett, 박사 드웨인 와이즈 박사 닐 첫번째 원고 편집을위한 Kourtney 윌킨슨 : 저자의 귀중한 도움을 인정하고 싶습니다 세자르 Monroy, 한나 스우프 및 MSU에서 동영상 제작과 함께 자신의 도움 바비 허들 스턴, 현미경 및 이미지 캡처와 함께 자신의 도움을. 이 연구는 미시시피 주립 대학에서 기관 연구 및 생물 과학학과 사무실에서 후원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10.5 - 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse. | |||
| Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC | SCRC-1040 | ||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Invitrogen | 14190/086 | |
| Collagenase /Dispase Solution | Roche Group | 269638 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Mitomycin C | Sigma-Aldrich | M4287 | |
| Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose | Invitrogen | 10566024 | |
| 10% Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000/044 | |
| 1% of antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | |
| Knockout Media: 80% knockout D-MEM | Invitrogen | 10829/018 | |
| 20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen | 25130/081 | with β-mercapt–thanol Sigma Catalogue Number: M7522 | |
| 1X non essential amino acid solution | Invitrogen | 11140/050 | |
| 1% antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15420/096 | supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106 |
| 40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech | 250-03 | ||
| 20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | |
| Corning center well culture dish 60mm | Fisher Scientific | 07-200-79 | 1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes |
| Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes. Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. |
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Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. |
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Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. |
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| Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet. | |||
References
- DeFelici, M. Cell Biology: A laboratory Handbook. 1, Second Edition, 73-85 (1998).
- Donovan, P. J., De Miguel, M. P. Turning Germ Cells into Stem Cells. Current Opinion in Genetics and Development. 13, 463-471 (2003).
- Labosky, P. A., Hogan, B. L. M. Part 12: Mouse Primordial Germ Cells: isolation and in vitro culture. Molecular embryology: methods and protocols. Sharp, P. T., Mason, I. 97, Humana Press. Totowa, NJ. (1999).
- Mc Laren, A., Southee, D. Entry of Mouse Embryonic Germ Cells into Meiosis. Developmental Biology. 187, 107-113 (1997).
- Yoshimizu, T., Obinata, M., Matsui, Y. Stage-specific tissue and cell interactions play key roles in mouse germ cell specification. Development. 128, 481-490 (2001).
- Zhang, J., Hhvorostov, I., Teitell, M. From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs. J Vis Exp. , (2008).
