Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

Summary

A capacidade de células germinais embrionárias de se diferenciarem em células germinativas primordiais durante estágios iniciais de desenvolvimento é um modelo perfeito para abordar nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias após a embriões de camundongos coitum.

Abstract

A capacidade de células germinais embrionárias (EG) de se diferenciar em células germinativas primordiais (PGCs) e mais tarde em gametas durante as primeiras fases de desenvolvimento é um modelo perfeito para resolver a nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias pós coitum embriões (DPC) do mouse. Desenvolvimento gonadal cumes de embriões de camundongos (C57BL6J) foram dissociadas pela ruptura mecânica com colagenase, então banhado em um rato camada de alimentador de embrião de fibroblastos (MEF-CF1) que foi previamente mitoticamente inativada com mitomicina C na presença de mídia nocaute e suplementada com inibidor de leucemia fator (LIF), fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) e fator de Stem Cell (SCF). Usando esses métodos otimizados para a identificação PCG, isolamento e estabelecimento de condições de cultura permite culturas de longo prazo de células EG por mais de 40 dias. O embrionárias linhagens de células germinais embrionárias mostrou fenótipo e expressão de marcadores utilizados comum do estado pluripotente. Isolamento e derivação de células germinais na cultura fornecer uma ferramenta para entender o seu desenvolvimento in vitro e oferecer a oportunidade de acompanhar os danos cumulativos ao nível genético e epigenético após a exposição ao estresse oxidativo.

Protocol

Parte 1: Laparotomia rato grávidas

1. Usando deslocamento cervical, euthanize um rato C57BL6J fêmea grávida em 10,5-11,5 dpc.
2. Limpe o abdômen com sabão antimicrobiano, e em seguida, fazer a barba dele.
3. Após o barbear, lavar o abdômen com uma solução salina.
4. Depois, seque o abdômen com uma gaze estéril.
5. Cobrir o mouse com um novo campo estéril.
6. Faça uma incisão ventral usando uma pinça e tesouras de dissecação.
7. Identificar e remover todo o útero da cavidade abdominal. Embriões de camundongos será visível dentro do útero.
8. Transferência do útero em uma placa de Petri cheia de D-PBS, e mantê-lo no gelo.
9. Usando um bisturi e pinças esterilizadas,, remova a placenta e extra tecidos embrionários de cada embrião.
10. Transferência de embriões em uma placa de Petri fresco cheio de D-PBS.
11. Meça o comprimento dos embriões mouse. Descobrimos que os tamanhos diferentes conforme a idade do embrião. Por exemplo 8,5 dpc medido a uma média de 6 mm, 10,5 dpc medido a uma média de 11mm, e 12,5 dpc medido a uma média de 16 mm.
12. Em seguida, retire suas caudas para extração de DNA.

Parte 2: Dissecção cume Gonadal

Sob estereomicroscópio e Luz fonte Schott Fostec

1. Coloque um papel de filtro numa placa de Petri. Então, coloque o embrião de rato em cima do papel de filtro para secar o embrião e imobilizar para dissecção.
2. Utilizando um escalpelo esterilizado, fazer um corte transversal do embrião de rato acima da origem do cordão umbilical.
3. Sob microscópio estereoscópico, utilizando uma pinça estéril fina e uma agulha estéril provocações bem, retire os intestinos e fígado para que o sistema urinário é visível.
   Os rins estão localizados lateralmente na cavidade abdominal, e da bexiga está localizado medial e caudal em comparação com os rins. O embrião pode ser identificado como do sexo masculino, porque os sulcos são gonadal localizados em cada lado da bexiga. No feminino, as cristas gonadais estão firmemente unido à extremidade caudal lateral dos rins.
4. Descasque o cume fora gonadal deslizando uma agulha por trás dele. A crista gonadal é removida cortando-se os tecidos que suportam.
5. Transferir os cumes gonadal para uma placa de Petri novo repleto de novas D-PBS.
   Microscopicamente, a crista gonadal masculino devem ser retirados, grandes e de formato oval. Em contraste, a crista gonadal feminina deve ser manchado, têm forma alongada e ser menor em comparação com a crista gonadal masculino.

Parte 3: Digestão cume Gonadal

Sob estereomicroscópio:

1. Mesonefro Dissection: gônadas o independente do mesonefro e crista utilizando uma agulha fina e afiada.
   • É importante remover a mesonefro do cume gonadal, porque é um tecido somático que overgrow no processo de derivação PGC.
2. Digestão cume gonadal: Colete limpa cumes gonadal em uma gota de doce 0.5ul D-PBS. Adicionar 20 ml de colagenase / Dispase Solution (concentração final de 1mg/ml).
   • Embriões devem ser processados ​​individualmente. Cada embrião deve ter o seu próprio separado e rotulado placa de Petri.
3. Gonadal cume Mincing: Corte a crista gonadal em pedaços pequenos usando uma agulha estéril e estéril pinças finas n º 4.
4. Incubação: placas de Petri são transferidos para uma incubadora a 37 ° C por 15 minutos.
   • O período de incubação pode variar entre os tecidos.
5. Pipetagem: Após 15 minutos, o tecido pode ser dissociada por pipetagem. Usando pipetas de vidro puxado capilares com diâmetros entre 40 milímetros -100 Quebre os pedaços pipetando cima e para baixo. Isto irá formar pequenos aglomerados. Transferir os pedaços de 0,5 ml de um pré aquecido queda de D-PBS para uma lavagem final.
6. Após a lavagem, transferir os pedaços de tubos de eppendorf.
   • Não mais expor o tecido a colagenase.
   • Não faça uma suspensão única célula. Isto é importante para a formação de colônia. Se é uma suspensão de células individuais, PGCs tendem a se diferenciar e migrar.
   • Este processo não deve ser superior a 20 minutos, ou suas células vão perder a viabilidade.
7. Centrifugar a 2000 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente.
8. Após a centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 0,5 ml de knock out complementada media (pré-aquecido a 37 ° C).

Parte 4: Primordial Cultura Células Germinal

"Você deve executar os próximos passos rapidamente para preservar a viabilidade de PGCs para isolamento e derivação.

1. 24 horas antes deste processo, você deve preparar uma mitoticamente inativado camada MEF-CF1 alimentador seguindo o protocolo de Zhang J. et al 2008.
   • Prepare 20 pratos para um pregnant rato fêmea (6-8 embriões).
   • MEFs perder a capacidade de ser uma camada de alimentação (promover o crescimento e evitar a diferenciação) após 5-6 passagens.
   • Não use MEFs com mais de 48 horas.
2. Imediatamente antes PGCs chapeamento, o meio MEF deve ser lentamente retirada da camada de alimentação MEF.
3. Em seguida, adicionar 0,5 ml / poço do pré-aquecido médio knockout suplementado para a camada de alimentação MEF.
   • MEF mídia contém soro fetal bovino que induz a diferenciação de PGCs.
   • Meio Knockout deve ser completada com fatores de crescimento específicos espécie imediatamente antes do uso para garantir a atividade do fator de crescimento.
4. Usando distribuição simétrica, PGCs placa sobre a camada de alimentação MEF.
   • Se estas partes estão muito perto, eles tendem a se agregar e fazer colônias densas que atribuem pouco ou começar a diferenciar.
   • Placas de cultura deve ser rotulado com o nome de linha de células embrionárias Germinal, o número de passagem, e data.
5. Cuidadosamente, transferir a placas de cultura em estufa a 37 ° C e 5% CO _2.
6. Monitorar as células a cada 24 horas.
7. Após 48 horas, retire 250 ml de mídia a partir do topo da cultura para evitar a perturbação anexo da colônia. Em seguida, adicione 250 ml de fresco suplementado knock-out de mídia (pré-aquecido a 37 ° C).
8. Após o passo 7, esperar mais 48 horas, e, em seguida, remover completamente todos os meios de comunicação e substituí-la por meio suplementado fresco knock-out (pré-aquecido a 37 ° C). Fazer isso a cada 2 dias por 8-10 dias até PGC formam colônias.

Parte 5: Células embrionárias Germinal

1. Após 10 dias de isolamento PGC, colônias de células embrionárias germinativas se formam.
2. Linhas de células germinais embrionárias são mantidas vivas por passagens manual de cada 8-10 dias. Eles continuam a apresentar uma morfologia indiferenciada e expressam marcadores de pluripotência, como alkalyne fosfatase, Oct-4, SSEA-1, e SOX-2

Notas

• Condições estéreis / assépticas são essenciais na sala de cultura.
• Para a derivação e cultura, PGCs são processados ​​em uma Classe II Purifier Gabinete de segurança Bio.
• Incubações estão em 37 ° C umidificada e 5% CO ₂ incubadora.
• Todos os meios e reagentes são filtrados antes de serem utilizados em um filtro de 0,2 um, armazenadas a 4 ° C, e pré-aquecido a 37 ° C antes do uso.
• Durante as etapas de dissecção, todos os embriões e tecidos devem ser mantidos no gelo.
• Todos os frascos de reagente são descontaminados com etanol antes de colocar em um armário.
• Uso de luvas, jaleco, enfermeira e bonés são obrigatórios.

Conclusão

Nós fornecemos um vídeo que mostra como isolar, retirar e cultura embrionárias células germinais de cristas gonadais de 10,5-11,5 embriões de camundongos dpc. O isolamento reprodutível e cultura a longo prazo de linhagens de células embrionárias germinal fornece um fundamento essencial para o estudo do desenvolvimento embrionário precoce, genéticas e epigenéticas padrões germinal, a formação das gônadas, os efeitos ambientais de órgãos adjacentes durante o processo de desenvolvimento da gametogênese nos embriões masculinos e femininos, e determinação dos caminhos que leva ao câncer e infertilidade.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10.5 - 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse.
Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC		SCRC-1040
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Invitrogen	14190/086
Collagenase /Dispase Solution	Roche Group	269638
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M4287
Trypsin EDTA	Invitrogen	25200-072
MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose	Invitrogen	10566024
10% Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000/044
1% of antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096
Knockout Media: 80% knockout D-MEM	Invitrogen	10829/018
20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen		25130/081	with β-mercapt–thanol Sigma Catalogue Number: M7522
1X non essential amino acid solution	Invitrogen	11140/050
1% antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096	supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106
40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech		250-03
20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF)	Invitrogen	13256-029
Corning center well culture dish 60mm	Fisher Scientific	07-200-79	1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes
Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes. Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.