Выделение и Вывод мышиных эмбриональных зародышевых клеток

Summary

Способность эмбриональных зародышевых клеток дифференцироваться в первичных зародышевых клеток на ранних стадиях развития является идеальной моделью для решения нашу гипотезу о раке и бесплодие. Этот протокол показывает, как изолировать первичный зародышевых клеток из развивающихся гонад в 10.5-11.5 дней после эмбрионов coitum мыши.

Abstract

Способность эмбриональных зародышевых клеток (EG) дифференцироваться в первичных зародышевых клеток (PGCs), а затем в гаметы во время ранних стадиях развития является идеальной моделью для решения нашу гипотезу о раке и бесплодие. Этот протокол показывает, как изолировать первичный зародышевых клеток из развивающихся гонад в 10.5-11.5 дней после coitum (ЦОД) эмбрионов мыши. Разработка половых хребты из мышиных эмбрионов (C57BL6J) были диссоциированы механическое разрушение с коллагеназа, а затем помещают в фибробласты эмбриона мыши фидерного слоя (MEF-CF1), который был ранее митотически инактивированные митомицином С в присутствии средств массовой информации нокаутом и дополнены лейкемии Ингибитор фактор (LIF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), и фактор стволовых клеток (SCF). Используя эти методы оптимизированы для PCG выявление, изоляцию, а также создание условий культивирования позволяет долгосрочных культурах Е. клетки в течение более 40 дней. Эмбриональных зародышевых линий эмбриональных клеток показали, фенотип и выражение общих использовать маркеры плюрипотентных государства. Выделение и вывод зародышевых клеток в культуре предоставить инструмент, чтобы понять их развитие в лабораторных и предлагают возможность контролировать совокупный ущерб на генетические и эпигенетические уровни после воздействия окислительного стресса.

Protocol

Часть 1: Беременные Лапаротомия мышь

1. Использование шейки дислокации, эвтаназии беременных женщин C57BL6J мыши на 10.5-11.5 DPC.
2. Чистая живота с антимикробным мылом, а затем, побрить его.
3. После бритья, мыть живот с физиологическим раствором.
4. Затем, сухой живот стерильной марлей.
5. Обложка мышь с новой стерильной области.
6. Сделать вентральный вырез использованием щипцов и рассечение ножницами.
7. Выявить и устранить все матки из брюшной полости. Мышь эмбрионы будут видны внутри матки.
8. Передача матки в чашку Петри заполнены D-PBS, и держать его на льду.
9. Используя стерильный скальпель и пинцет, удалите плаценты и эмбриональных тканей дополнительные каждого эмбриона.
10. Трансфер эмбрионов в свежем чашке Петри заполнены D-PBS.
11. Измерьте длину эмбрионов мыши. Мы обнаружили, что размеры отличаются в зависимости от возраста эмбриона. Например 8,5 DPC измеряется в среднем на 6 мм, 10.5 DPC измеряется в среднем на 11 мм и 12,5 DPC измеряется в среднем 16 мм.
12. Затем удалите их хвосты выделения ДНК.

Часть 2: гонад Dissection Ридж

Под стереомикроскопа и источник света Schott Fostec

1. Место фильтровальную бумагу в чашке Петри. Затем поместите эмбриона мыши в верхней части фильтровальной бумаге высохнуть эмбриона и парализовать для вскрытия.
2. Используя стерильный скальпель, сделать поперечный срез эмбриона мыши над происхождения пуповины.
3. Под стереомикроскопа, с помощью стерильного пинцета и тонкой стерильной тонкой иглой дразнить, удалить кишечник и печень, так что мочевыделительной системы видна.
   Почки расположены горизонтально в брюшной полости, и мочевого пузыря находится медиальной и хвостового по сравнению с почками. Эмбриона могут быть определены как мужские, так как половая хребты расположены по обе стороны мочевого пузыря. У женщин, половая хребты прочно прикреплены к боковым хвостового конца почки.
4. Пил из половых хребта, сдвинув иглу за ним. Половых хребта удален убирания тканей, которые поддерживают его.
5. Передача половых хребтов на новую чашку Петри заполнены свежими D-PBS.
   Микроскопически мужской половых хребте должны быть удалены, большие и овальной формы. В отличие от женщины половых хребта должно быть заметили, имеют удлиненную форму и быть меньше, по сравнению с мужской половых хребта.

Часть 3: гонад Пищеварение Ридж

Под стереомикроскопа:

1. Мезонефрос Препарирование: Отдельная гонады от мезонефрос и конька с помощью тонкой и острой иглой.
   • Важно, чтобы удалить мезонефрос от половых хребта, потому что это ткань соматических которые перерастают в процессе вывода PGC.
2. Гонад Пищеварение Ридж: Соберите чистых половых хребтов 0.5ul капля свежей D-PBS. Добавьте 20 мл коллагеназы / Dispase Решение (конечная концентрация в 1mg/ml).
   • Эмбрионы должны быть обработаны по отдельности. Каждый эмбрион должен иметь свой собственный отдельный и маркированы Петри.
3. Гонад Ридж Минцинг: Cut половых хребта на мелкие части, используя стерильные иглы и стерильной тонкой щипцы № 4.
4. Инкубация: чашки Петри передаются в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 15 минут.
   • Инкубационный период может варьироваться между тканями.
5. Пипетирование: После 15 минут, ткани могут быть отделены с помощью пипетки. Использование вытащил стеклянный капилляр пипетки с диаметром от 40 мм -100 Разбейте произведения пипетирования вверх и вниз. Это образуют небольшие скопления. Передача сгустки в 0,5 мл предварительно нагревается D-PBS капли для последней промывки.
6. После мытья, передача сгустки в Эппендорф труб.
   • Не более чем подвергать ткани коллагеназы.
   • Не делайте суспензии отдельных клеток. Это важно для образования колоний. Если это суспензии отдельных клеток, PGCs, как правило, дифференцироваться и мигрировать.
   • Этот процесс не должен быть длиннее 20 минут, или ваши клетки теряют жизнеспособность.
7. Центрифуга при 2000 оборотов в минуту в течение 5 минут при комнатной температуре.
8. После центрифугирования, удалить супернатант, и ресуспендируют осадок в 0,5 мл дополнен выбить средства массовой информации (Pre-нагревают при 37 ° С).

Часть 4: Изначальная Жерминаль культуры клеток

"Вы должны выполнить следующие шаги быстро сохранить жизнеспособность PGCs для изоляции и словообразования.

1. 24 часа до начала этого процесса необходимо подготовить митотически инактивированных MEF-CF1 фидерного слоя следующий протокол от Чжан Дж. и др. 2008 год.
   • Подготовка 20 блюд для одного pregnaNT женский мыши (6-8 эмбрионов).
   • MEFs теряют способность быть фидерного слоя (стимулирования роста и предотвращения дифференциации) через 5-6 пассажей.
   • Не используйте MEFs старше 48 часов.
2. Непосредственно перед покрытием PGCs, средний MEF должны быть постепенно удалены из слоя фидерных MEF.
3. Затем добавьте 0,5 мл / лунку подогретого дополнен нокаутом среды на уровень подачи MEF.
   • MEF носитель содержит эмбриональной телячьей сыворотки, которая индуцирует дифференциацию PGCs.
   • Нокаут среда должна быть дополнена породы специфических факторов роста непосредственно перед употреблением для обеспечения деятельности растут фактор.
4. Использование симметричного распределения пластины PGCs по слою фидерные MEF.
   • Если эти части находятся слишком близко, они склонны к агрегации и сделать густые заросли, которые крепятся плохо или начать дифференциации.
   • Культура блюда должны быть помечены Эмбриональные Жерминаль название линии клеток, прохождение номер и дату.
5. Осторожно, передача культуры блюда в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
6. Монитор клетки каждые 24 часа.
7. Через 48 часов, удалите 250 мл СМИ из самой вершине культуры не мешать привязанности колонии. Затем добавьте 250 мл свежей дополнен нокаут средств массовой информации (предварительно нагревают при 37 ° С).
8. После шага 7, ждать еще 48 часов, а затем полностью удалить все средства массовой информации и заменить его на свежий дополнен нокаут средств массовой информации (предварительно нагревают при 37 ° С). Делайте это раз в 2 дня в течение 8-10 дней, пока форма PGC колоний.

Часть 5: Эмбриональные зародышевых клеток

1. После 10 дней изоляции PGC, эмбриональных зародышевых колонии образуются ячейки.
2. Эмбриональные зародышевые линии клеток поддерживается по сей день руководство проходов каждые 8-10 дней. Они по-прежнему представляют недифференцированной морфологией и выразить плюрипотентности маркеров, таких как alkalyne фосфатазы, Oct-4, SSEA-1, и SOX-2

Примечания

• Стерильные / асептических условиях играют важную роль в культуре комнате.
• Для вывода и культуры, PGCs обрабатываются в очиститель Класс II кабинета безопасности Bio.
• Инкубацию находятся в увлажненном 37 ° С и 5% СО ₂ инкубатора.
• Все средства массовой информации и реагентов фильтруются перед использованием в 0,2 мкм фильтр, хранить при температуре 4 ° С, и предварительно нагревают при 37 ° С до использования.
• Во время вскрытия шаги, все эмбрионы и ткани должны храниться на льду.
• Все реагенты колбы обеззаражены с этанолом до размещения в шкафу.
• Использование перчатки, халат, и медсестра шапки, являются обязательными.

Заключение

Мы предоставили видео, которое показывает, как изолировать, получать и культуры эмбриональных зародышевых клетках половых хребтов 10.5-11.5 эмбрионов DPC мыши. Воспроизводимые изоляции и долгое культуры термин эмбриональных зародышевых линиях клеток представляет собой важнейшую основу для изучения раннего эмбрионального развития, генетических и эпигенетических зародышевых узоры, гонад формирования, экологические последствия окружающие органы во время процесса развития гаметогенеза в мужские и женские эмбрионы, и определение путей, что приводит к раку и бесплодию.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10.5 - 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse.
Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC		SCRC-1040
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Invitrogen	14190/086
Collagenase /Dispase Solution	Roche Group	269638
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M4287
Trypsin EDTA	Invitrogen	25200-072
MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose	Invitrogen	10566024
10% Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000/044
1% of antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096
Knockout Media: 80% knockout D-MEM	Invitrogen	10829/018
20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen		25130/081	with β-mercapt–thanol Sigma Catalogue Number: M7522
1X non essential amino acid solution	Invitrogen	11140/050
1% antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096	supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106
40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech		250-03
20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF)	Invitrogen	13256-029
Corning center well culture dish 60mm	Fisher Scientific	07-200-79	1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes
Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes. Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.