El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

Summary

La capacidad de las células germinales embrionarias a diferenciarse en células germinales primordiales durante etapas tempranas del desarrollo es un modelo perfecto para hacer frente a nuestra hipótesis sobre el cáncer y la infertilidad. Este protocolo se muestra la forma de aislar las células germinales primordiales de las gónadas en desarrollo de embriones de 10.5 a 11.5 días después de ratón coitum.

Abstract

La capacidad de las células germinales embrionarias (EG) a diferenciarse en células germinales primordiales (PGC) y más tarde en los gametos durante las primeras etapas de desarrollo es un modelo perfecto para hacer frente a nuestra hipótesis sobre el cáncer y la infertilidad. Este protocolo se muestra la forma de aislar las células germinales primordiales de las gónadas en desarrollo en 10.5-11.5 días después de embriones de ratón coitum (dpc). El desarrollo de las crestas gonadales de embriones de ratón (C57BL6J) se disocian por rotura mecánica con colagenasa, está chapada en una capa de fibroblastos de embriones de ratón de alimentación (MEF-CF1) que antes era mitóticamente inactivados con mitomicina C en la presencia de los medios de octavos de final y que será completada con un inhibidor de la leucemia Factor (LIF), el factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF), y factor de células madre (SCF). El uso de estos métodos optimizados para la identificación del PCG, el aislamiento, y el establecimiento de condiciones de cultivo permite que las culturas a largo plazo de las células EG de más de 40 días. Las líneas embrionarias germinales de células mostró fenotipo embrionario y la expresión de marcadores utilizados común del estado pluripotente. El aislamiento y la derivación de células germinales en la cultura una herramienta para entender su desarrollo in vitro y ofrece la oportunidad de controlar el daño acumulado en los niveles genéticos y epigenéticos que después de la exposición al estrés oxidativo.

Protocol

Parte 1: La laparotomía ratón embarazadas

1. Por dislocación cervical, la eutanasia a una mujer embarazada ratón C57BL6J femenina en 10,5-11,5 DPC.
2. Limpia el abdomen con jabón antiséptico, y luego, se le exige.
3. Después de afeitarse, lavar el abdomen con una solución salina.
4. A continuación, seque el abdomen con una gasa estéril.
5. Cubrir el ratón con un campo estéril.
6. Haga una incisión ventral con las pinzas y tijeras de disección.
7. Identificar y eliminar todo el útero de la cavidad abdominal. Embriones de ratón será visible en el interior del útero.
8. Transferencia al útero en una placa Petri llena con D-PBS, y mantener en hielo.
9. Con un bisturí estéril y pinzas, extraer la placenta y extra tejidos embrionarios de cada embrión.
10. La transferencia de embriones en una nueva placa de Petri llena de D-PBS.
11. Medir la longitud de los embriones de ratón. Encontramos que el tamaño difiere según la edad del embrión. Por ejemplo 8,5 dpc medido en un promedio de 6 mm, 10,5 dpc medido en un promedio de 11 mm, y el 12,5 dpc medido en un promedio de 16 mm.
12. Luego, quite la cola para la extracción de ADN.

Parte 2: Disección cresta gonadal

Bajo microscopio estereoscópico y Fuente de luz Schott Fostec

1. Coloque un papel de filtro en una placa de Petri. Luego, coloque el embrión de ratón en la parte superior del papel de filtro para secar el embrión e inmovilizar a la disección.
2. Con un bisturí estéril, hacer un corte transversal del embrión de ratón por encima del origen del cordón umbilical.
3. Bajo un microscopio estereoscópico, utilizando unas pinzas finas estéril y una aguja estéril burla fina, quitar los intestinos y el hígado para que el aparato urinario esté visible.
   Los riñones están situados lateralmente en la cavidad abdominal, y la vejiga se encuentra medial y caudal en comparación con los riñones. El embrión puede ser identificado como masculino porque las crestas gonadales se encuentran a ambos lados de la vejiga. En la mujer, las crestas gonadales están firmemente sujeto al extremo caudal lateral de los riñones.
4. Pelar la cresta gonadal a cabo por el deslizamiento de una aguja detrás de él. La cresta gonadal se elimina cortando los tejidos que la sostienen.
5. Transferencia de las crestas gonadales a una nueva placa de Petri llena de frescos D-PBS.
   Microscópicamente, la cresta gonadal masculino debe ser despojado, grandes y ovalados. Por el contrario, la cresta gonadal femenino debe ser visto, tienen forma alargada y ser más pequeño en comparación con la cresta gonadal masculino.

Parte 3: La digestión cresta gonadal

Bajo microscopio estereoscópico:

1. Disección mesonefros: Separar la gónada del mesonefros y el canto con una aguja fina y afilada.
   • Es importante eliminar el mesonefros de la cresta gonadal, ya que es un tejido somático, que crecen en exceso en el proceso de derivación PGC.
2. La digestión cresta gonadal: Recoger limpia crestas gonadales en una gota de agua dulce 0.5ul D-PBS. Añadir 20 ml de colagenasa / Dispasa solución (concentración final en 1mg/ml).
   • Los embriones deben ser tratados individualmente. Cada embrión debe tener su propio plato de petri separados y etiquetados.
3. Gonadal canto Picado: Corte la cresta gonadal en trozos pequeños con una aguja estéril y estéril pinzas finas N º 4.
4. Incubación: placas de Petri se transfieren a una incubadora a 37 ° C durante 15 minutos.
   • El tiempo de incubación puede variar entre los tejidos.
5. Pipeteo: Después de 15 minutos, el tejido se puede disociar con pipeta. Utilizando sacó pipetas capilares de vidrio con un diámetro entre 40 mm -100 Romper las piezas pipeteando arriba y hacia abajo. Esto formará pequeños grupos. La transferencia de los macizos de 0,5 ml de una pre calentado D-PBS caída de un lavado final.
6. Después del lavado, la transferencia de los grupos a los tubos eppendorf.
   • No más de exponer el tejido de la colagenasa.
   • No haga una suspensión de células individuales. Esto es importante para la formación de colonias. Si se trata de una suspensión de células individuales, PGCs tienden a diferenciar y migrar.
   • Este proceso no debe ser superior a 20 minutos, o sus células pierden su viabilidad.
7. Centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
8. Después de centrifugar, separar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 0,5 ml de golpear complementado con los medios de comunicación (pre-calentado a 37 ° C).

Parte 4: Cultura células germinales primordiales

"Usted debe realizar los siguientes pasos rápidamente para preservar la viabilidad de PGCs para el aislamiento y la derivación.

1. 24 horas antes de este proceso debe preparar una mitóticamente inactivadas MEF-CF1 alimentador de capa, siguiendo el protocolo de Zhang J. et al 2008.
   • Preparar 20 platos de un pregnant hembra del ratón (6-8 embriones).
   • MEFs perder la capacidad de ser una capa de alimentación (promover el crecimiento y evitar la diferenciación) después de 5-6 pasajes.
   • No use más de 48 horas MEFs.
2. Inmediatamente antes de PGCs recubrimiento, el medio MEF debe retiran lentamente de la capa de alimentación MEF.
3. A continuación, añadir 0,5 ml / pocillo de pre-calentado medio suplementado por nocaut en la capa de alimentación MEF.
   • MEF medios de comunicación contiene suero bovino fetal al que induce la diferenciación de PGCs.
   • Medio de octavos de final debe ser complementado con factores de crecimiento específico de especie inmediatamente antes de su uso para asegurar la actividad del factor de crecimiento.
4. Mediante la distribución simétrica, PGCs placa sobre la capa de alimentación MEF.
   • Si estas piezas están muy cerca, que tienden a agruparse y hacer densas colonias que se adhieren mal o comienzan a diferenciarse.
   • Placas de cultivo deben ser etiquetados con el nombre de embrión línea celular germinal, el número de pases, y la fecha.
5. Con cuidado, la transferencia de las placas de cultivo en una incubadora a 37 ° C y 5% CO _2.
6. Monitor de las células cada 24 horas.
7. Después de 48 horas, eliminar 250 ml de los medios de comunicación de la parte superior de la cultura para no molestar a la adhesión de la colonia. A continuación, añadir 250 ml de agua dulce complementado knock-out medios de comunicación (pre-calentado a 37 ° C).
8. Después del paso 7, esperar otras 48 horas, y luego, eliminar por completo todos los medios de comunicación y sustituirlo por nuevos medios de comunicación complementado knock-out (pre-calentado a 37 ° C). Haga esto cada dos días durante 8-10 días hasta el PGC formar colonias.

Parte 5: embrionario las células germinales

1. Después de 10 días de aislamiento PGC, colonias de células germinales embrionarias se forman.
2. Líneas de células germinales embrionarias se mantiene vivo gracias a pasajes manual de cada 8-10 días. Siguen presentando una morfología indiferenciada y expresan marcadores de pluripotencialidad como alkalyne fosfatasa, Oct-4, SSEA-1 y Sox-2

Notas

• Condiciones de esterilidad / asepsia son esenciales en la sala de la cultura.
• Para la derivación y la cultura, PGCs se procesan en un gabinete de seguridad Clase II purificador Bio.
• Incubaciones se encuentran en una húmeda 37 ° C y 5% de CO ₂ incubadora.
• Todos los medios y los reactivos son filtrados antes de su uso en un filtro de 0,2 um, se almacenan a 4 ° C, y pre-calentado a 37 ° C antes de su uso.
• Durante los pasos de la disección, todos los embriones y los tejidos se debe mantener en hielo.
• Todos los frascos de reactivos deben descontaminarse con etanol antes de colocar en un armario.
• El uso de guantes, bata de laboratorio, y las tapas de la enfermera son obligatorios.

Conclusión

Hemos proporcionado un video que muestra cómo aislar, se derivan, y la cultura de las células germinales embrionarias a partir de las crestas gonadales de 10.5-11.5 embriones de ratón DPC. El aislamiento reproducibles y la cultura a largo plazo de las líneas de células germinales embrionarias proporciona una base fundamental para el estudio del desarrollo embrionario temprano, los patrones germinal genética y epigenética, la formación de las gónadas, los efectos ambientales de los órganos circundantes durante el proceso de desarrollo de la gametogénesis en los embriones masculinos y femeninos, y la determinación de las vías que conduce al cáncer e infertilidad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10.5 - 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse.
Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC		SCRC-1040
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Invitrogen	14190/086
Collagenase /Dispase Solution	Roche Group	269638
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M4287
Trypsin EDTA	Invitrogen	25200-072
MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose	Invitrogen	10566024
10% Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000/044
1% of antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096
Knockout Media: 80% knockout D-MEM	Invitrogen	10829/018
20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen		25130/081	with β-mercapt–thanol Sigma Catalogue Number: M7522
1X non essential amino acid solution	Invitrogen	11140/050
1% antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096	supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106
40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech		250-03
20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF)	Invitrogen	13256-029
Corning center well culture dish 60mm	Fisher Scientific	07-200-79	1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes
Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes. Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.