Isolering och Härledning av Mouse Embryonala Germinal celler

Summary

Förmågan hos embryonala embryon cellerna differentieras till primordial embryon celler under tidiga utvecklingsskeden är ett perfekt sätt att hantera vår hypotes om cancer och infertilitet. Detta protokoll visar hur man kan isolera ursprungliga embryon celler från att utvecklas gonaderna 10,5-11,5 dagar mus inlägg coitum embryon.

Abstract

Förmågan hos embryonala embryon celler (t.ex.) att differentieras till ursprungliga embryon celler (PGCs) och senare i könsceller under tidiga utvecklingsstadier är en perfekt modell för att ta itu med vår hypotes om cancer och infertilitet. Detta protokoll visar hur man kan isolera ursprungliga embryon celler från att utvecklas gonaderna 10,5-11,5 dagar efter coitum (DPC) musembryon. Utveckla gonad åsar från mus embryon (C57BL6J) har tagit avstånd genom mekanisk störning med kollagenas, sedan beläggas med en mus embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) som tidigare var mitotically inaktiveras med mitomycin C i närvaro av knockout medier och kompletteras med leukemi Inhibitor Factor (LIF), grundläggande Fibroblast Growth Factor (bFGF) och Stem Cell Factor (SCF). Med hjälp av dessa optimerade metoder för PCG identifiering, isolering, och etablering av odlingsbetingelser tillåter långsiktiga kulturer av EG celler för mer än 40 dagar. Den embryonala embryon cellinjer visade embryonala fenotyp och uttryck för gemensamma används markörer av pluripotenta staten. Isolering och härledning av embryon celler i kultur som ett verktyg för att förstå deras utveckling in vitro och ger möjlighet att följa kumulativa skador på genetisk och epigenetisk nivå efter exponering för oxidativ stress.

Protocol

Del 1: Gravida Mouse Laparotomy

1. Använda halsdislokation, euthanize en gravid C57BL6J hanmöss vid 10,5-11,5 DPC.
2. Rengör buken med antimikrobiell tvål, och sedan, raka den.
3. Efter rakning, tvätta buken med en saltlösning.
4. Sedan torka buken med en steril gasbinda.
5. Täck med musen med ett nytt sterilt område.
6. Gör en ventral snitt med hjälp av pincett och sax dissekering.
7. Identifiera och ta bort hela livmodern från bukhålan. Musembryon kommer att synas inne i livmodern.
8. Överför livmodern i en petriskål fylld med D-PBS, och hålla den på is.
9. Med en steril skalpell och pincett, ta bort moderkakan och extra embryonala vävnader av varje embryo.
10. Överför embryon i en ny petriskål fylld med D-PBS.
11. Mät längden på musembryon. Vi fann att de storlekar som varierade beroende på embryots ålder. Till exempel 8,5 DPC värderas till i genomsnitt 6 mm, mätt 10,5 DPC i genomsnitt 11mm och 12,5 DPC värderas till ett genomsnitt på 16 mm.
12. Ta sedan bort sina svansar för DNA-extraktion.

Del 2: gonad Ridge Dissection

Under stereomikroskop och ljuskälla Schott Fostec

1. Placera ett filtrerpapper i en petriskål. Sedan placerar musen embryot på toppen av filtret papper att torka embryot och immobilisera för dissekering.
2. Med en steril skalpell görs ett tvärsnitt av musen embryot ovanför ursprung navelsträngen.
3. Enligt ett stereomikroskop, med steril fin pincett och en steril fin retas nål, ta bort tarmen och levern så att urinvägarna är synlig.
   Njurarna är placerade i sidled i bukhålan, och urinblåsan ligger mediala och stjärtfenan i jämförelse med njurarna. Embryot kan identifieras som män eftersom gonadala åsarna finns på vardera sidan av blåsan. Hos kvinnor är de gonadala åsarna ordentligt fäst den bakre laterala slutet av njurarna.
4. Skala gonadala åsen ut genom att skjuta en nål bakom. Den gonad åsen tas bort genom att skära bort de vävnader som stöder den.
5. Överför gonadala åsar till en ny petriskål fylld med färska D-PBS.
   Mikroskopiskt, bör den manliga gonadala åsen tas bort, stora och ovala. Däremot bör den kvinnliga gonadala åsen vara fläckig, har avlång form och bli mindre i jämförelse med den manliga könsceller åsen.

Del 3: gonad Ridge Digestion

Under stereomikroskop:

1. Mesonephros Dissection: Separera gonad från mesonephros och åsen med en fin och skarp nål.
   • Det är viktigt att ta bort mesonephros från gonadala åsen eftersom det är en somatisk vävnad som kommer att växa över i PGC härledningen processen.
2. Gonad Ridge Uppslutning: Samla ren gonad åsar i ett 0.5ul droppe färsk D-PBS. Tillsätt 20 ml kollagenas / Dispase Solution (Slutlig koncentration på 1mg/ml).
   • Embryon bör behandlas individuellt. Varje embryo bör ha en egen separat och märkt petriskål.
3. Gonad Ridge Mincing: Skär gonadala åsen i små bitar med en steril nål och sterila fin pincett nr 4.
4. Inkubering: petriskålar överförs till en inkubator vid 37 ° C i 15 minuter.
   • Inkubationstiden kan variera mellan olika vävnader.
5. Pipettering: Efter 15 minuter kan vävnad skiljas genom att pipettera. Använda drog glas kapillärpipett med diametrar mellan 40 -100 mm Dela upp bitarna genom att pipettera upp och ned. Detta kommer att bilda små klumpar. Överför klumpar till 0,5 ml en uppvärmd före D-PBS släppa en sista tvätten.
6. Efter tvättning, överföra klumpar till Eppendorf-rör.
   • Dra inte utsätta vävnaden till kollagenas.
   • Gör inte en enda cell suspension. Detta är viktigt för koloni bildas. Om det är en enda cell fjädring, PGCs tenderar att differentiera och migrera.
   • Denna process bör inte vara längre än 20 minuter, eller dina celler kommer att förlora livskraft.
7. Centrifugera vid 2000 rpm i 5 minuter i rumstemperatur.
8. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 0,5 ml kompletteras slå ut media (förvärmas vid 37 ° C).

Del 4: Primordial Germinal Cells Kultur

"Du bör utföra nästa steg snabbt för att bevara livskraften i PGCs för isolering och härledning.

1. 24 timmar innan denna process du bör förbereda en mitotically inaktiverat MEF-CF1 feeder layer efter protokollet från Zhang J. et al 2008.
   • Förbered 20 rätter för en pregnant hanmöss (6-8 embryon).
   • MEFs förlora förmågan att vara en feeder layer (främja tillväxt och förhindra differentiering) efter 5-6 passager.
   • Använd inte MEFs äldre än 48 timmar.
2. Omedelbart före plätering PGCs måste MEF mediet långsamt bort från MEF-mataren lagret.
3. Lägg sedan till 0,5 ml / brunn av förvärmda kompletteras knockout mediet på MEF matare lagret.
   • MEF medier innehåller fetalt bovinserum som inducerar differentiering av PGCs.
   • Knockout mediet måste kompletteras med specie specifika tillväxtfaktorer omedelbart före användning för att säkerställa aktivitet växer faktor.
4. Använda symmetrisk fördelning, plåt PGCs över MEF matare lagret.
   • Om dessa bitar är för nära, de tenderar att aggregera och göra täta kolonier som fäster dåligt eller börjar differentiera.
   • Kultur rätter måste märkas med embryonala Germinal cellinje namn, passage nummer och datum.
5. Försiktigt, för över kultur rätter i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO _2.
6. Övervaka celler per 24 timmar.
7. Efter 48 timmar, ta bort 250 ml media från toppen av kulturen för att undvika att störa kolonins bilagan. Lägg sedan till 250 ml rent kompletteras knock-out media (förvärmas vid 37 ° C).
8. Efter steg 7, vänta ytterligare 48 timmar, och sedan, helt ta bort alla medier och ersätta den med färsk kompletteras knock-out media (förvärmas vid 37 ° C). Gör detta varje 2 dagar i 8-10 dagar tills PGC kolonier form.

Del 5: Embryonala Germinal Cells

1. Efter 10 dagar av PGC isolerat, embryonala könsceller cell kolonier bildas.
2. Embryonala könsceller cellinjer hålls vid liv genom manuell passager varje 8-10 dagar. De fortsätter att presentera en odifferentierad morfologi och uttrycka pluripotens markörer som alkalyne fosfatas, oktober-4, SSEA-1, och SOX-2

Anteckningar

• Sterila / aseptiska förhållanden är viktiga i kulturen rummet.
• För härledning och kultur, är PGCs behandlas i ett reningsverk klass II Bio säkerhetsbänk.
• Inkubationer är i en fuktig 37 ° C och 5% CO ₂ inkubator.
• All media och reagens filtreras före användning i en 0,2 um filter, lagras vid 4 ° C och förvärmda vid 37 ° C före användning.
• Under dissektion stegen måste alla embryon och vävnader hållas på is.
• Alla reagens flaskor är dekontamineras med etanol innan de placeras i ett skåp.
• Användning av handskar, skyddsrock, och mössor sjuksköterska är obligatoriska.

Slutsats

Vi har försett en video som visar hur du isolera, härleda och kultur embryonala könsceller celler från gonad åsar av 10,5-11,5 DPC musembryon. Den reproducerbara isolering och lång sikt kultur av embryonala embryon cellinjer ger en kritisk grund för studier av tidig embryonal utveckling, genetiska och epigenetiska embryon mönster, gonad formation, miljöeffekter av omgivande organ under utvecklingsprocessen av gametogenes i manliga och kvinnliga embryon, och bestämning av vägar som leder till cancer och infertilitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10.5 - 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse.
Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC		SCRC-1040
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Invitrogen	14190/086
Collagenase /Dispase Solution	Roche Group	269638
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M4287
Trypsin EDTA	Invitrogen	25200-072
MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose	Invitrogen	10566024
10% Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000/044
1% of antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096
Knockout Media: 80% knockout D-MEM	Invitrogen	10829/018
20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen		25130/081	with β-mercapt–thanol Sigma Catalogue Number: M7522
1X non essential amino acid solution	Invitrogen	11140/050
1% antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096	supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106
40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech		250-03
20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF)	Invitrogen	13256-029
Corning center well culture dish 60mm	Fisher Scientific	07-200-79	1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes
Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes. Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.